Comparaison de l’analyse histopathologique, de la culture et des tests de réaction en chaîne de la polymérase pour détecter les infections invasives dues à la moisissure à partir d’échantillons de biopsie

Contexte Avec l’avènement de nouveaux agents antifongiques, l’identification d’un agent pathogène responsable est cruciale pour guider le traitement antifongique de l’infection invasive par les moisissures. Cependant, les cultures tissulaires échouent souvent à développer un pathogène fongique en cas de suspicion d’infection à moisissures. ont comparé les résultats d ‘analyses histopathologiques, de cultures et d’ ampli – cations en chaîne par polymérase identifiant des espèces d ‘Aspergillus et des Zygomycètes en tant qu’agents causant des infections invasives dues à des moisissures prélevées chez des patients immunodéprimés soupçonnés d’ infection par des moisissures. spécimens de tissus Hyphae correspondait soit à l’aspergillose n = ou zygomycose n = ou ne pouvait pas être précisée n = Une moule a été cultivée à partir d’échantillons d’aspergillus hyphae, d’échantillons avec Zygomycetes hyphae, et d’échantillons avec des hyphae non spécifiées Polymerase rior à la culture dans la détection de la moisissure infectante des échantillons vs des échantillons, respectivement; P = d’échantillons histopathologiquement positifs L’identification du genre ou de l’espèce par séquençage des produits de la réaction en chaîne de la polymérase était conforme aux résultats de culture des échantillons positifs en culture. Les deux tests de réaction en chaîne par polymérase ne détectaient pas l’ADN fongique. Les tests de PCR offrent un diagnostic étiologique fiable qui est supérieur à la culture chez les patients ayant une infection invasive par la moisissure Ceci peut améliorer la gestion du patient par une thérapie antifongique adaptée lorsque les cultures ne parviennent pas à développer un agent pathogène

Une infection invasive de la muqueuse des voies respiratoires est une complication importante chez les patients immunodéprimés atteints de tumeurs malignes hématologiques ou ayant subi une greffe d’organe solide Bien qu’Aspergillus fumigatus soit l’agent causal le plus répandu, d’autres Aspergillus et Zygomycètes sont récemment apparus comme d’importants pathogènes opportunistes En raison des différentes susceptibilités in vitro de ces agents pathogènes émergents à l’augmentation du nombre d’agents antifongiques, la définition de l’étiologie microbienne exacte des infections invasives de moisissure devient de plus en plus importante pour guider le traitement antifongique. l’utilisation de techniques non invasives peut représenter une colonisation, plutôt qu’une infection, et ~% d’échantillons d’organes ayant des résultats histopathologiques positifs ont des résultats de culture négatifs Par conséquent, une thérapie antifongique guidée par la connaissance de l’agent causal n’est possible que chez une minorité de patients Ce peut avoir contribué à l’échec d’un traitement antifongique chez des patients porteurs d’infections fongiques invasives dues à des organismes pharmacorésistants in vitro. Nous avons déjà démontré que l’utilisation de tests PCR séminalisés ciblant l’ADN mitochondrial des espèces Aspergillus et l’ADN ribosomique S des zygomycètes, l’ADN de la moisissure peut être obtenu à partir de spécimens de tissus fixés au formol, ce qui permet d’identifier les pathogènes fongiques au niveau du genre ou de l’espèce Nous présentons les résultats d’une étude prospective comparant les tests de PCR troubles des règles. infection invasive par des moisissures avec des procédures standard, c.-à-d. analyse histopathologique et culture à l’aide de spécimens de biopsie non fixés prélevés chez des patients ayant eu une infection présumée de la moisissure

Méthodes

Étude des patients

Une infection invasive par la moisissure a été définie comme une nouvelle fièvre ou une augmentation des taux de protéine C réactive et une lésion d’organe nouvelle ou progressive suggérant une infection invasive par moisissure qui s’est développée ou a progressé lors de la réception d’un traitement antibactérien à large spectre. ou sans halo environnant, infiltrats pulmonaires cavitants, opacification des sinus détectés par TDM haute résolution ou lésions endobronchiques typiques détectées par bronchoscopie. La biopsie dépend de la localisation de la lésion et de l’état du patient dans les lésions périphériques, pleurales, une biopsie guidée par CT utilisant une aiguille -gauge et – passe par la plèvre a été réalisée bronchoscopie et thoracoscopie vidéo-assistée ont été préférés chez les patients qui avaient subi une transplantation pulmonaire ou qui recevaient une ventilation mécanique Contre-indications pour la biopsie comprenait un temps de thromboplastine partielle & gt; sec, un nombre de plaquettes & lt ;, plaquettes / μL, et un temps de prothrombine & gt; Tous les patients ont obtenu le consentement éclairé, en accord avec les exigences locales, des universités de Francfort et de Tübingen. Préparation des biopsies Les échantillons de biopsie ont été soigneusement divisés par les enquêteurs VR ou EP en les coupant avec un couteau Les tests PCR ont été réalisés centralement par RB à Tübingen en Allemagne en quelques mois d’échantillonnage. Les échantillons ont été conservés congelés à-° C jusqu’à l’extraction de l’ADN. Les chercheurs effectuant les tests moléculaires ont été aveuglés à des tests cliniques, Données microbiologiques et histopathologiques L’analyse histopathologique et la culture ont été réalisées à Francfort, en Allemagne, sauf pour les échantillons prélevés sur des patients à Vienne, en Autriche.Analyse histopathologique L’acide periodique-Schiff et la coloration à l’argent méthénamine de Grocott ont été utilisés pour détecter les hyphes dans les tissus. cla Les hyphes hyalines hyalines à ramification dichotomique ou à zygomycètes larges, rubanées, pauciseptées, à ramification à angle droit, décrites précédemment Les hyphes de moules ne correspondant pas aux caractéristiques morphologiques typiques des espèces d’Aspergillus ou des Zygomycètes ont été classées comme étant des espèces de Aspergillus. Une analyse histopathologique spécifique a été définie comme la preuve d’une étiologie typique, comme un lymphome. L’analyse histopathologique était considérée comme non spécifique si les résultats n’étaient pas caractéristiques d’une pathologie spécifique, par exemple, des tissus nécrosés ou des changements fibrotiques en l’absence d’une Les pathogènes fongiques ont été cultivés sur gélose Sabouraud dextrose à ° C dans l’air ambiant pendant des jours. Des cultures bactériennes ont été effectuées sur du sang de mouton et de la gélose au chocolat à ° C en% de dioxyde de carbone. atmosphère Tous les médias ont été obtenus commercialement Becton Dickinson Heidelberg, Allemagne Des cultures de mycobactéries ont été réalisées en MB Redox Heipha pendant des semaines à ° C. L’identification des pathogènes fongiques et bactériens cultivés a été réalisée en utilisant des techniques standards. Méthodes moléculaires L’extraction d’ADN a été réalisée comme décrit précédemment. ADN mitochondrial des espèces Aspergillus PCR Aspergillus et l’ADN ribosomique S de Zygomycetes Zygomycètes PCR ont été utilisés Des contrôles négatifs, positifs et d’extraction ont été utilisés selon des procédures standard Des produits PCR ont été détectés par des gels colorés au bromure d’éthidium après électrophorèse Les amplicons ont été séquencés comme précédemment Les produits de PCR décrits qui étaient <%> homologues avec les séquences des espèces Zygomycetes ou Aspergillus déposées dans GenBank ont ​​été considérés comme étant des amplifications non spécifiques, et les résultats de PCR ont été déclarés négatifs Définitions La neutropénie était définie comme un nombre de neutrophiles & lt; L’administration systémique de glucocorticostéroïdes, d’inhibiteurs de la calcineurine ou de mycophénolate mofétil a été définie comme l’administration systémique d’agents antifongiques ayant une activité in vitro contre les moisissures, par exemple, l’itraconazole, le voriconazole, le posaconazole, la caspofungine, ou l’immunosuppression. Amphotéricine B pendant les jours précédant la biopsie La précision diagnostique d’une infection invasive par la moisissure a été classée selon les critères de l’Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer / Mycoses du National Institute of Allergy and Infectious Diseases Méthodes statistiques Les variables catégorielles ont été comparées en utilisant le test χ ou le test exact de Fisher, comme indiqué. Pour les variables continues, le test de Wilcoxon a été utilisé. AP valeur & lt; dans un test unilatéral a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

Nous avons inclus des échantillons de biopsie consécutifs Deux échantillons ont été exclus de l’analyse: les deux patients avaient une présentation clinique suggérant une aspergillose pulmonaire et ont répondu au voriconazole. Dans l’échantillon, l’aspergillose invasive a été confirmée histopathologiquement mais les cultures étaient stériles. Le PCR amplifiant l’ADN humain est resté négatif dans les tests. Ceci reflète probablement des quantités insuffisantes de tissu dans l’échantillon envoyé pour le test PCR. Dans le second échantillon, seul le tissu pleural a été observé dans l’analyse histopathologique. Les conditions sous-jacentes, les facteurs de risque d’infection fongique invasive et les organes à partir desquels les échantillons de biopsie analysés ont été prélevés chez les patients restants sont listés dans le tableau Le nombre moyen de plaquettes au moment de la biopsie était, plaquettes / μL, – plaquettes / μL, le temps moyen de prothrombine était c intervalle, – sec, et le temps moyen de thromboplastine partielle était la gamme sec, – sec

Tableau View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients suspects d’infection invasive par moisTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients suspectés d’infection invasive par moisissureBiopsies ont été réalisées sous la direction de CT n =, bronchoscopie n =, et chirurgie thoracoscopique assistée par vidéo n = Spécimens des sinus paranasaux n = et les tissus mous n = ont été obtenus en utilisant des méthodes chirurgicales.Les complications des biopsies guidées par TDM comprenaient une hémorragie mineure sans besoin d’un soutien de RBC emballé chez les patients et des pneumothorax qui se résolvaient spontanément chez les patients. Résultats histopathologiques. Recherche et traitement du cancer / mycoses Groupe d’étude des critères de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses , avec la présence d’hyphes dans les échantillons de tissus en% des patients Hyphae ont été considérés comme indicatifs d’aspergillose dans les échantillons et zygomycose de samp les% spécification d’hyphes n’était pas possible dans les échantillons%, soit en raison d’une faible quantité d’éléments fongiques n = ou d’une morphologie inhabituelle Pour les patients% avec des spécimens dans lesquels les hyphes n’étaient pas observés, une étiologie alternative a été détectée du poumon chez les patients, maladie de Hodgkin chez le patient, alors que chez les patients%, des résultats histologiques non spécifiques ont été obtenus En% de ces échantillons, des modifications inflammatoires compatibles avec une pneumonie fongique sans détection d’hyphes ont été observées. / Mycoses groupe d’étude de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses critères , de ces patients ont été classés comme ayant une infection invasive moule, alors que le patient a été classé comme ayant une infection probable de la moisissure invasive

cultivé: Un fumigatus dans les échantillons, Aspergillus flavus dans l’échantillon, Aspergillus niger dans l’échantillon et Trichoderma longibrachiatum dans l’échantillon Seul% des échantillons ayant eu des zygomycètes hyphae ont développé un zygomycète: espèce Rhizopus dans l’échantillon et Rhizomucor pusillus dans l’échantillon P = en% des échantillons Dans un échantillon, un flavus a été cultivé à partir d’un échantillon de biopsie sinusale sans détection d’hyphes dans l’échantillon par analyse histopathologique. Cependant, parce que les résultats de CT étaient compatibles avec une infection invasive et parce que le patient répondait à un antifongique. En revanche, dans un autre échantillon qui avait des résultats négatifs par analyse histopathologique, Penicillium citrinum a été cultivé sur une plaque de gélose et a été considéré comme une contamination. La durée médiane du prétraitement antifongique était de – jours dans les cas positifs pour la culture par rapport aux jours, – jours dans les cas négatifs pour la culture Dans les échantillons, diverses bactéries gram-positives saprophytes ont été cultivées. Dans des échantillons, des bactéries pathogènes facultatives ont été cultivées Pseudomonas aeruginosa dans des échantillons, Stenotrophomonas maltophilia dans des échantillons, et Staphylococcus aureus dans des échantillons. des hyphes ont été observés dans ces échantillons pendant l’analyse histopathologique, une inflammation aiguë a été détectée dans les cas par analyse histopathologique sans détection d’hyphes de la moisissure. Dans ces cas, des échantillons avec P aeruginosa et un échantillon avec S maltophilia, les bactéries isolées ont pu causer l’infection. être résistants in vitro aux antibactériens appliqués Deux de ces patients se sont améliorés après l’ajout d’antibactériens sensibles in vitro, et le patient est mort du choc septique réfractaire Toutes les cultures de mycobactéries sont restées stériles Identification des espèces par PCR En utilisant la PCR, des moisissures ont été détectées en% sa La seule PCR des espèces d’Aspergillus a eu des résultats positifs dans les échantillons%, y compris tous les échantillons dans lesquels des hyphes typiques d’Aspergillus ont été détectés. et A niger dans l’échantillon Chaque In des échantillons qui avaient des hyphes non spécifiées, l’espèce Aspergillus PCR a révélé un ADN spécifique à un fumigatus Un de ces échantillons a grandi A fumigatus En outre, des échantillons dont les hyphes n’ont pas été obtenus ont des résultats positifs par les espèces Aspergillus PCR Un échantillon a été prélevé chez un patient présentant une sinusite A flavus a été cultivé à partir de cet échantillon et les résultats du séquençage du produit PCR ont été conformes aux résultats de culture.Dans un autre échantillon d’un patient présentant une possible aspergillose, un ADN fumigatus amplifié par PCR Les cultures sont restées stériles L’analyse histologique a révélé une infiltration de neutrophiles d’une bronche Une revue rétrospective de la TDM obtenue au cours de la biopsie a montré que l’aiguille se trouvait à la périphérie d’une lésion typique entourée d’un halo. Le patient a répondu au voriconazole, suggérant une aspergillose invasive comme l’indique la PCR. Le PCR zygomycète seul avait résultats positifs en% d’échantillons, dont positifs par analyse histologique Des séquences ont été obtenues à partir de R pusillus ou Rhizomucor miehei, qui partagent la même séquence et ne peuvent pas être différenciées en utilisant cette PCR à partir d’échantillons; de l’échantillon d’Absidia corymbifera; Les résultats d’identification par PCR étaient en accord avec les résultats de culture dans les deux échantillons positifs à la culture. Dans un échantillon où des hyphes zygomycètes ont été détectés par analyse histopathologique et des cultures stériles, la PCR des espèces Aspergillus et la PCR Zygomycètes ont simultanément des résultats positifs. indiquant une double infection avec A fumigatus et R microsporus selon le séquençage Dans l’échantillon stérile qui a révélé une pneumonie organisée en utilisant l’analyse histopathologique, la PCR Zygomycètes était positive pour R pusillus CT a révélé un infiltrat cavitating compatible avec invasive zygomycose, alors que l’évolution clinique, dans laquelle infiltrats ont régressé lentement en réponse au traitement antibactérien, soutient une étiologie bactérienneLes deux tests PCR ont eu des résultats négatifs dans l’échantillon culture négative ayant des hyphes non spécifiés, suggérant que l’infection pourrait avoir été causée par une moisissure qui n’a pas pu être détectée par ces tests. cela a fait n’ont pas d’hyphes dans les échantillons de tissus et ont des résultats de culture négatifs, les deux tests PCR ont eu des résultats négatifs. L’identification de la moisissure infectante a été possible en utilisant la PCR en% des échantillons de biopsie histologiquement positifs; en revanche, la culture des échantillons de biopsie a révélé une moisissure dans seulement% des échantillons P = Identification de l’espèce par PCR et les résultats de séquençage étaient en accord avec les résultats de culture en% d’échantillons positifs pour la culture

Discussion

De plus, à notre connaissance, il s’agit de la première étude prospective comparant le rendement de la culture et de la PCR dans des échantillons tissulaires consécutifs. La plupart des études de PCR exclues Zygomycètes, alors que nous avons pu détecter les espèces d’Aspergillus et Zygomycètes les plus communes qui émergent maintenant comme agents pathogènes fongiques importants. En outre, grâce à l’utilisation de tests PCR séparés, nous avons pu détecter une double infection. ont été décrits en% de patients atteints de zygomycose dans les séries et sont probablement difficiles à diagnostiquer en utilisant une culture conventionnelle et une analyse histopathologiqueIdentification de l’agent causal d’une infection de moisissure au niveau espèce ou genre est nécessaire, car la sensibilité in vitro varie selon les Aspergillus espèces et différents genres de zygomycètes En combinant les tests PCR, nous avons pu détecter les plus communs les agents étiologiques des infections invasives à moisissures – c’est-à-dire A fumigatus, A flavus et les agents de zygomycose – dans les centres participants. Cependant, comme l’infection due à Aspergillus terreus, Aspergillus ustus ou A niger est plus courante dans d’autres centres, Un échantillon négatif à la PCR dans la présente série qui présentait des hyphes de moisissures inhabituelles d’aspergillose ou de zygomycose suggère que des amorces supplémentaires pourraient être nécessaires pour détecter l’ADN de moisissures supplémentaires, telles que Fusarium espèces ou Pseudallescheria boydii Bien que les résultats de l’identification des espèces par séquençage correspondent aux résultats de culture en% des échantillons positifs pour la culture dans notre étude, ils diffèrent dans les cas Les résultats discordants peuvent être expliqués par contamination ou par double infection non reconnue par culture. De plus, les agents pathogènes fongiques rares ne peuvent être identifiés en utilisant notre approche si les séquences ciblées d’organismes rares ne sont pas Par conséquent, la comparaison de notre méthode avec d’autres stratégies basées sur la PCR pour détecter les moisissures dans les échantillons de biopsie doit être effectuée pour définir l’utilité des différentes approches. Bien que la PCR suggère un agent étiologique dans des échantillons histopathologiquement négatifs, la pertinence de ces résultats est difficile. Cependant, l’évolution clinique de l’infection dans les deux cas était évocatrice d’une aspergillose invasive, et le nombre d’échantillons faussement positifs obtenus par les tests de PCR semble être Dans une série de cas rétrospectifs incluant des patients atteints de maladies hématologiques et d’une suspicion d’aspergillose pulmonaire, l’aspergillose n’a pas pu être confirmée après la résection de lésions suspectes dans l’étude. % des patients Lorsque des biopsies guidées par CT sont utilisées pour confirmer Aspergillose invasive spiculée chez des patients neutropéniques atteints de tumeurs malignes hématologiques, des signes inflammatoires non spécifiques ont été décrits en% des biopsies Bien que le nombre de biopsies soit faible, les résultats inflammatoires non spécifiques ont été plus fréquents dans notre étude Différences dans le mode de biopsie et Les caractéristiques des patients pourraient expliquer ces différences. Premièrement, le rendement diagnostique des biopsies pulmonaires guidées par TDM pourrait être plus élevé avec un nombre accru de passages pleuraux, comme cela a été utilisé dans les séries précédentes . Cependant, une grande quantité d’hyphes et moins d’inflammation a été décrite dans des échantillons de tissus de patients neutropéniques et de modèles animaux, alors que la quantité d’éléments fongiques détectés est plus faible et l’inflammation est plus prononcée chez les non neutropéniques. patients et animaux traités avec des corticostéroïdes. La détection fréquente de lésions inflammatoires non spécifiques dans notre étude peut refléter l’évolution des facteurs de risque d’infections invasives dues à la moisissure, c’est-à-dire l’utilisation plus fréquente de glucocorticoïdes par rapport aux études précédentes [,,] En évaluant le pour et le contre une moisissure à partir de prélèvements tissulaires des voies respiratoires, cette approche semble inappropriée pour le diagnostic précoce de l’infection par les moisissures Etant donné l’utilisation croissante, en prophylaxie ou en thérapie empirique, des nouveaux antifongiques actifs contre les espèces d’Aspergillus et l’émergence de moisissures Comme les espèces Zygomycètes ou Aspergillus, résistantes aux azoles , la biopsie peut devenir un outil utile pour l’obtention d’un diagnostic étiologique chez les patients prétraités présentant une infection progressive par la moisissure. l’analyse et la culture, car cela permet une thérapie antifongique guidée dans une plus grande proportion de f patients

Remerciements

Soutien financier Gilead Pharmaceuticals Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit