Dépendance sur le corécepteur CCR pour la réplication virale explique le manque de rebond des variantes du VIH prédites par CXCR chez le patient de Berlin

Le «patient de Berlin» est le premier patient guéri de l’infection par le VIH après transplantation allogénique avec des cellules souches de corécepteurs CCR non fonctionnelles https://suhagra.org. Nous démontrons que les virus minoritaires prédits par CXCR présents avant la transplantation étaient incapables de rebondir après la transplantation en raison de la dépendance au CCR

Le «patient de Berlin» est le premier patient guéri de l’infection par le VIH après transplantation allogénique avec des cellules souches coréceptrices CCR non fonctionnelles. Nous démontrons que les virus minoritaires prédits par CXCR présents avant la transplantation étaient incapables de rebondir après la transplantation en raison de leur dépendance au CCR pour la réplication. barrière génétique élevée vers l’utilisation de CXCR

VIH, cure, Berlin-Patient, corécepteur, greffe de cellules souchesLe «patient berlinois» est le premier individu à avoir guéri le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) après une transplantation allogénique pour traiter la leucémie myéloïde aiguë Les cellules souches utilisées étaient homozygote pour la mutation du cadre de lecture Δ CCRΔ, entraînant l’absence du récepteur CCR à la surface cellulaire L’hétérozygotie pour CCRΔ est associée à une progression plus lente de la maladie, et les individus homozygotes pour CCRΔ sont naturellement résistants au VIH CCR-tropique glycoprotéine gp d’enveloppe à un corécepteur CCR ou CXCR est essentiel pour l’entrée du VIH dans les cellules hôtes CD Le tropisme du corécepteur VIH est principalement déterminé par la troisième boucle hypervariable de l’enveloppe virale gp-V Le patient berlinois avait une charge virale plasmatique de × copies / mL pendant un épisode d’interruption du traitement avant la greffe de cellules souches SCT On a prédit que la population virale serait à tropisme CCR selon la norme test de tropisme notypique GenoPheno [corécepteur] taux de faux positifs [FPR]% Une analyse détaillée utilisant le séquençage ultradeep a détecté une% de population virale minoritaire prédit être CXCR-tropic GenoPheno [corécepteur] gamme FPR,% -% Deux mois après SCT, succès On a observé une reconstitution des cellules T CD avec le phénotype CCRΔ homozygote Ces cellules T dérivées donnaient des niveaux normaux d’expression de surface du corécepteur CXCR. Étant donné la détection de variants viraux prédits par CXCR avant SCT, on s’attendrait à ce que ces variants apparaissent après SCT, d’autant plus que la thérapie antirétrovirale a été interrompue pendant la procédure de transplantation. Cependant, aucun rebond viral n’a été observé, et le patient est resté indemne d’infection par le VIH pour & gt; années post-SCT Auparavant, nous avons démontré que certains virus capables d’utiliser CXCR ont clairement une préférence de corécepteur CCR in vivo Sur la base de ces résultats, nous postulons qu’un rebond des variantes prédites par CXCR chez le patient de Berlin n’a pas eu lieu en raison de la dépendance au corécepteur CCR pour la réplication virale

Méthodes

Tropisme corécepteur VIH a été évaluée in silico en utilisant différents outils de prédiction: GenoPheno [corécepteur] , matrices de notation spécifiques à la position Web PSSMX-R , la – règle , et la charge nette Données supplémentaires Le résultat du GenoPheno interprétation du [corécepteur] est donnée comme une valeur quantitative, le FPR, qui définit la probabilité de classer un virus CCR-prédit faussement comme variante prédit par CXCR Le système GenoPheno [corécepteur] est basé sur une méthode d’apprentissage statistique appelée machine de vecteur de support qui Pour étudier la capacité de réplication virale et la dépendance des corécepteurs, nous avons généré des virus recombinants Parce que les séquences d’enveloppe complètes n’ont pas été générées avant SCT, nous avons cloné gp dérivé du patient -V séquences en boucle des virus prédits par CXCR et la souche prédite CCR la plus dominante du patient dans le contexte d’une souche de référence de laboratoire utilisant CXCR pH XB-Δgp-V Comme contrôle, nous avons également introduit gp-V de HXB ou CCR-tropic BaL dans le fond de pHXB-Δgp-V Données supplémentaires Coreceptor préférence des virus recombinants a été évaluée dans les cellules T U-MAGI-CCRE et Lignes cellulaires U-MAGI-CXCRCEM exprimant CDCCRCXCR- ou CDCCR-CXCR ou dans des cellules cibles naturelles cellules mononucléées du sang périphérique du donneur sain [PBMC] ou PBMC provenant du patient post-SCT en présence ou en l’absence d’inhibiteurs du corécepteur Des tests ont été réalisés pour étudier l’évolution vers l’utilisation de CXCR. Les variants viraux CXCR-prédits recombinants Xbp et Xbp et le variant Rbp prédit par CCR ou le virus témoin cBaL ont été cultivés en continu dans un pourcentage croissant de cellules U-MAGI-CXCRCEM.

RÉSULTATS

prédiction du tropisme des corécepteurs des séquences de boucles gp-V dérivées du patient obtenues avant la transplantation de cellules souches Représentation schématique des séquences d’acides aminés de la boucle gp-V du variant prédictif CCR dérivé du patient Rbp et des variantes minoritaires prédites par CXCR, Xbp-Xbp, et les virus témoins cBaL et cHXB Prédiction génotypique du tropisme par GenoPheno [co-récepteur]% taux de faux positifs , PSSMX-R, règle de charge nette, et / est donnée La prédiction du CCR est indiquée en vert; Prédiction de CXCR en rougeNous avons étudié la capacité réplicative virale de ces variants par clonage de la séquence de la boucle gp-V dérivée du patient dans le squelette de la souche de référence HXB tropicale CXCR Les souches dominantes prédites par CCR et CXCR parmi lesquelles le A, analyse de la capacité de réplication dans les cellules mononucléaires du sang périphérique PBMC provenant de donneurs sains exprimant les deux corécepteurs CCR et picogramme CXCR [pg] surnageant p / μL au jour B, l’utilisation des corécepteurs a été déterminée en exprimant le pourcentage d’entrée virale dans les cellules CXCR ou CCR U-MAGI C, capacité de réplication dans les PBMC provenant de donneurs sains avec un antagoniste μM MVC CCR ou un antagoniste μM AMD-CXCR ou sans inhibiteur. pg p / μL surnageant au jour J, Capacité de réplication dans les PBMC dérivées de patients obtenues après CCR homozygote allogénique -La greffe de cellules souches SCT telle que testée avec μM AMD- ou sans inhibiteur pg p / μL surnageant aux jours cHXB et cBal ont été utilisés comme virus de contrôle Rbp est la construction virale CCR prédite dominante et Xbp-Xbp sont le viable GenoPheno [corécepteur CXCR Constructions virales prédites Les barres d’erreur sont l’écart-type des puits quadruplés Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois, et les figures sont basées sur des expériences représentativesFonctionnalité de la capacité de réplication et de l’utilisation des corécepteurs phénotypiques A, Capacité de réplication dans les cellules mononucléaires du sang périphérique exprimant les deux corécepteurs CCR et CXCR picogramme [pg] p / μL surnageant au jour B, l’utilisation Coreceptor a été déterminée en exprimant le pourcentage d’entrée virale dans CXCR ou cellules CCR U-MAGI C, la capacité de réplication dans PBMCs de donneurs sains avec μM MVC CCR antagoniste ou antagoniste d’AMD-CXCR μM ou sans inhibiteur pg p / μL surnageant au jour J, capacité de réplication dans des PBMC dérivées de patients obtenus après une greffe allogénique homozygote de cellules souches CCR-Δ SCT comme testé avec uM AMD- ou sans inhibiteur pg p / ul surnageant aux jours cHXB et cBal ont été utilisés comme virus de contrôle Rbp est la construction virale prédite par CCR et Xbp-Xbp sont les constructions virales viables de GenoPheno [corécepteur CXCR-prévu Les barres d’erreur sont l’écart-type des puits quadruplicas Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois, et les figures sont basées sur des expériences représentatives. ou CXCR comme corécepteur La souche prédite CCR prédominante du patient Rbp et du virus témoin CCR-tropique cBaL ont pu infecter les cellules exprimant le CCR mais pas celles exprimant CXCR. Figure B La souche de référence CXCR-tropique cHXB a seulement pu infecter les cellules exprimant CXCR reflétant un phénotype CXCR complet Remarquablement, tous les variants CXCR-prédits dérivés de patients, y compris Xbp, répliquées seulement La préférence du corécepteur peut différer dans les lignées cellulaires par rapport aux cellules cibles naturelles exprimant les deux corécepteurs, nous avons également évalué l’utilisation du corécepteur dans les PBMC Nous avons utilisé le maraviroc MVC, un antagoniste du CCR, pour imiter le rapport CCRΔ / Δ dans les cellules exprimant le CCR. De même, nous avons utilisé AMD pour bloquer la liaison des corécepteurs CXCR. Comme attendu, la souche prédite par CCR et cBaL prédominante dérivée du patient était complètement inhibée par MVC et non par AMD- Figure C, reflétant un phénotype CCR complet Le virus témoin cHXB était complètement Il est intéressant de noter que les variants prédits par CXCR n’étaient pas inhibés par l’AMD mais démontraient une dépendance du RCC dans les cellules cibles naturelles, comme le montre l’inhibition complète de la réplication par MVC. si les constructions virales pouvaient se répliquer dans les PBMC CCR-Δ / Δ dérivées post-transplantation du patient de Berlin Ces expériences ont montré que les nouvelles cellules cibles du patient de Berlin peuvent être infecté par une souche de référence CXCR-tropique, mais pas avec les virus dérivés du patient pré-SCT Figure DGiven la présence de macrophages CCR-positifs à longue durée de vie nous avons exploré le potentiel d’évolution vers l’utilisation de CXCR. Le cBaL du virus de contrôle du tropisme CCR et le Rbp, Xbp et Xbp dérivés du patient ont été cultivés en présence de pourcentages croissants de cellules exprimant CXCR% -% Après des semaines de sélection, aucun corécepteur n’a été observé, suggérant une barrière génétique relativement élevée. vers l’utilisation de CXCR

DISCUSSION

Le patient de Berlin est le premier patient à avoir contracté une infection par le VIH Avant la SCT, la population virale était génotypée et une population minoritaire était censée utiliser le corécepteur CXCR alternatif dans un algorithme Web GenoPheno [corécepteur] Considérant les niveaux normaux de Il était remarquable que le VIH ne rebondisse pas post-SCT en l’absence de combinaison de thérapie antirétrovirale cART Notre étude démontre que les virus minoritaires prédit CXCR-prédit les virus minoritaires prédit par CXCR sur les cellules dérivées du donneur et la susceptibilité de ces cellules au virus CXCR-tropic. Les déterminants principaux de l’utilisation des corécepteurs sont la boucle gp-V Les algorithmes de prédiction génotypique, tels que GenoPheno [corécepteur], utilisent cette fonction avant la transplantation pour ne pas rebondir après transplantation en raison de leur dépendance au CCR pour la réplication et une barrière génétique élevée envers l’utilisation de CXCR. région pour prédire le tropisme des corécepteurs Le résultat de l’interprétation de GenoPheno [corécepteur] est donné sous forme de valeur quantitative, le FPR, qui définit La probabilité de classer un virus CCR-prédit faussement comme variant prédit par CXCR Varier la valeur seuil pour la classification FPR change la sensibilité et la spécificité pour la prédiction de tropisme CXCR En pratique clinique, les valeurs FPR de coupure conservatrices qui montrent de bonnes corrélations avec le résultat virologique pendant CCR inhibiteur- Les taux de FPR les plus bas parmi les variantes minoritaires chez le patient berlinois avant le SCT étaient de% Bien que ce taux soit inférieur au FPR le plus bas suggéré pour prédiction de tropisme basée sur le séquençage profond% et donc génotypiquement prédite pour être tropicale CXCR, la variante était dépendante de CCR pour l’entrée virale dans les essais phénotypiques Cette étude de cas unique montre que le tropisme prédicteur génotypique des co-récepteurs peut ne pas toujours refléter le comportement biologique et suggère sont nécessaires pour explorer l’utilisation d’un FPR de seuil inférieur pour l’éligibilité au maraviroc dans Pratique clinique Dans le cas d’une procédure CCRΔ-SCT, un test FPR et / ou phénotypique plus clément devrait être envisagé. Les régions enveloppantes en dehors de la séquence gp-V peuvent moduler l’affinité du corécepteur , et les tests d’utilisation du corécepteur phénotypique sont basés sur presque toute la longueur. séquences d’enveloppe représentant le virus de la population plasmatique Malheureusement, avant le SCT, aucune séquence d’enveloppe complète n’a été générée par le patient de Berlin et aucun autre échantillon n’a été stocké pour permettre le séquençage complet de l’enveloppe. les variants minoritaires et ont été limités aux séquences de boucle V générées par séquençage ultradeep avant SCT En l’absence de séquences d’enveloppe complètes dérivées du patient, nous avons décidé de cloner les séquences de boucle gp-V du patient de Berlin dans le contexte d’un tropicale CXCR Souche VIH-laboratoire pour limiter le biais de l’utilisation du RCC Chez le patient de Berlin, les cellules permissives à tropisme CCR peuvent encore être détectées pendant au moins Plusieurs mois après le SCT, des niveaux extrêmement faibles d’ADN et d’ARN du VIH ont été détectés par intermittence en utilisant des tests très sensibles Compte tenu de la combinaison instable de CCR à longue durée de vie. La réplication résiduelle des virus à tropisme CCR dans le cadre de l’augmentation du nombre de cellules CCR-CXCR peut alors entraîner une évolution vers l’utilisation de CXCR Nous avons testé le potentiel d’évolution pour le plus grand nombre de cellules. CXCR-prédit des virus dérivés du patient et n’a pas observé l’évolution virale vers l’utilisation de CXCR, suggérant une barrière relativement élevée pour le commutateur corécepteur De plus, il a également été supposé que le nombre de cellules CD exprimant CCR résiduelles après SCT était trop faible pour soutenir la réplication des variants à tropisme CCR et donc évolution vers l’utilisation de CXCR Une étude récente dans laquelle les patients CCRΔ hétérozygotes infectés par le VIH avec une petite virale rvoir a reçu une greffe CCRWT / WT en présence de cART malheureusement démontré un rebond viral après interruption de cART Chez le patient berlinois, mis à part l’absence de virus CXCR-tropic, l’absence de rebond du virus CCR-tropique SCT en l’absence de cART indique que la transplantation de cellules souches CCRΔ / Δ était essentielle à la guérison apparente du VIH Ces résultats fournissent une justification pour SCT CCR et des études de thérapie génique dans lesquelles une analyse en profondeur de l’utilisation du corécepteur VIH est essentielle

Remarques

Remerciements Les auteurs remercient le patient berlinois et le Dr A Thielen pour avoir fourni des informations sur la séquence de la boucle gp-V. Soutien financier Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention VIDI de l’Organisation Néerlandaise de Recherche Scientifique Ce travail a été partiellement subventionné par la Fondation Roi Baudouin KBS grant -R-, BelgiumPots d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués