Les neutrophiles peuvent être un vecteur de réplication virale et de dissémination dans l’influenza aviaire humaine H5N1

Le mécanisme de la propagation systémique du virus H5N1 chez les patients atteints de grippe aviaire est inconnu Ici, la nucléoprotéine H5N1 et l’hémagglutinine ont été identifiées par immunohistochimie dans le noyau et cytoplasme des neutrophiles dans le sang placentaire d’une femme enceinte L’ARN viral a été détecté dans les neutrophiles par hybridation in situ Par conséquent, les neutrophiles peuvent servir de véhicule pour la réplication virale et le transport dans la grippe aviaire.

Conformément à la Déclaration d’Helsinki, les procédures ont été approuvées par le Comité administratif de recherche de l’Université de Pékin Beijing, Chine caustique. L’immunohistochimie a été réalisée comme décrit ailleurs [4] Les anticorps monoclonaux contre la nucléoprotéine NP et l’hémagglutinine HA ont été utilisés pour identifier le NP spécifique au virus H5N1. Les anticorps monoclonaux contre les marqueurs cellulaires des neutrophiles CD15, des lymphocytes CD20 B, des lymphocytes T CD3 et des macrophages CD68 ont été utilisés pour identifier des types de cellules spécifiques, à une dilution de 1: 100 Les anticorps secondaires contre les anticorps primaires ont été marqués à la peroxydase de raifort. et la réaction colorée a été développée avec un kit de réaction de peroxydase de raifort 3-amino-9-éthylcarbazole; Zymed Laboratories, qui a produit un signal rouge Lorsque le double marquage a été effectué, des anticorps secondaires marqués à la phosphatase alcaline ont été utilisés pour identifier les anticorps primaires contre NP, et la réaction colorée a été développée avec le tétrazolium nitro / 5-bromo-4-choloro- 3-indolyl phosphate Promega, qui a entraîné un signal violet-bleu Omission des anticorps primaires a également été utilisé comme un test de contrôle négatif L’hybridation in situ a été réalisée comme décrit ailleurs [1] Des sondes spécifiques contre les séquences d’ARN NP et HA ont été utilisées [1] La réaction colorée a été développée avec le tétrazolium nitro bleu / phosphate de 5-bromo-4-choloro-3-indolyle Promega, qui a abouti à un signal bleu-violet. Les échantillons de tissus témoins positifs et négatifs étaient identiques à ceux utilisés pour l’immunohistochimie. types de cellules avec CD15 comme marqueur des neutrophiles Dans ce cas, nous avons utilisé le bleu violet pour les signaux NP et le rouge pour les signaux CD15, pour obtenir un bon contraste avec les meilleurs éclairages. La colocalisation du virus H5N1 et du marqueur cellulaire En bref, l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ pour détecter l’antigène NP ou la séquence d’ARN NP a été réalisée en premier, et la réaction colorée a été développée pour donner un signal bleu-violet. des anticorps monoclonaux contre le marqueur neutrophile CD15 et la réaction colorée a été développée pour donner un signal rouge Des réactions de contrôle supplémentaires ont été réalisées pour vérifier la spécificité du double marquage, comme décrit ailleurs [1] La microdissection laser est une technique de microdissection visuelle sous microscope optique pour microdissecter et recueillir des échantillons de tissus de zones d’intérêt dans une section de tissu, en utilisant l’énergie d’un faisceau laser Dans ce cas, des accumulations de neutrophiles dans le sang dans les sections de tissu placentaire ont été disséqués pour recueillir des populations pures de neutrophiles une séquence spécifique de H5 dans ces cellules par microdissection RT-PCR Laser a été réalisée, selon o Le protocole d’un système de microdissection Leica, sur des coupes tissulaires de 8 μm d’épaisseur préparées sur des lames de verre recouvertes de membrane Les leucocytes disséqués d’un placenta non infecté servaient de groupe témoin négatif Pour établir que les fragments viraux provenaient de leucocytes et non d’autres éléments dans le sérum, des zones de pool sanguin adjacentes à des villosités placentaires sans leucocytes ont été microdisséquées en tant que groupe témoin provenant des mêmes coupes de tissus que celles à partir desquelles les groupes témoins négatifs supplémentaires ont été obtenus. PCR en temps réel classique TaqMan, en raison de l’ajout d’une étape de préamplification de gène cible pour précéder TaqMan PCR fluorescente en temps réel [5, 6] extractions d’ARN du groupe test, le groupe témoin négatif, et le groupe blanc ont été réalisées selon les méthodes de Masuda et al [7] Les échantillons ont été homogénéisés dans un tampon de digestion avec de la protéinase K Merck KGaA L’ARN total a été préparé ed avec Trizol Invitrogen et a été incubé dans un tampon Tris-EDTA pH 75 à 70 ° C pendant 60 min. Le gène HA du virus H5N1 a été détecté par PCR en temps réel améliorée, comme décrit ailleurs [6, 7] Le produit d’amplification un premier tour de PCR a été utilisé comme matrice pour un second tour de PCR en temps réel TaqMan, avec le même ensemble d’amorces amorce directe, 5′-gTg AYA ATg AAT gYA Tgg AA-3 ‘; amorce inverse, 5’-CCA IAA AgA YAg ACC AgCTA-3 ‘; sonde, FAM-AGT-AAAATTGGAATC-AATRGGAAT-BHQRésultats Un sous-ensemble de leucocytes dans les coupes de tissus placentaires a montré des résultats positifs d’immunocoloration avec les anticorps HA et NP, et ces cellules se sont révélées être des neutrophiles. En outre, le double marquage immunohistochimique avec anticorps contre le marqueur neutrophile CD15 a révélé une colocalisation cellulaire avec NP. Ces cellules NP-positives ont ainsi été établies sans équivoque comme neutrophiles figure 1C, et le H5N1 le taux d’infection virale parmi ces cellules CD15-positives était d’environ 30%. Les neutrophiles immunopositifs ont également été observés dans les données de rate non montrées.

Figure 1View grandDownload slideNucleoprotein NP et hémagglutinine détectés dans les neutrophiles A, coloration à l’hématoxyline et l’éosine après décoloration de la réponse immunocoloration positive effectuée pour identifier les neutrophiles flèches noires; barre, 20 μm B, Immunohistochimie avec anticorps contre NP 1: 300; Abcam effectué pour identifier les protéines virales dans les noyaux des neutrophiles brun-rouge; flèches noires; barre, 20 μm C, CD15 brun-rouge, flèche noire également présente dans les cellules NP-positives violet-bleu, flèche noire; barre, 50 μm L’insert b montre l’agrandissement d’une cellule mise en évidence par une flèche dans l’insert a, indiquant clairement la co-localisation de la protéine virale NP et du marqueur neutrophile CD15 dans la même barre cellulaire, 10 μmFigure 1View largeDownload slideNucleoprotein NP et hémagglutinine détectée dans les neutrophiles A, Hematoxylin et la coloration à l’éosine après décoloration de la réponse d’immunocoloration positive réalisée pour identifier les neutrophiles flèches noires; barre, 20 μm B, Immunohistochimie avec anticorps contre NP 1: 300; Abcam effectué pour identifier les protéines virales dans les noyaux des neutrophiles brun-rouge; flèches noires; barre, 20 μm C, CD15 brun-rouge, flèche noire également présente dans les cellules NP-positives violet-bleu, flèche noire; barre, 50 μm L’insert b montre l’agrandissement d’une cellule mise en évidence par une flèche en insert a, indiquant clairement la co-localisation de la protéine virale NP et du marqueur neutrophile CD15 dans la même barre cellulaire, 10 μmAvec la technique d’hybridation in situ, des séquences nucléotidiques H5N1 ont été détectées dans les neutrophiles putatifs Le double marquage de CD15 et d’ARN viral les a co-localisés dans les mêmes cellules, établissant en outre que ces cellules contenant l’ARN du virus H5N1 étaient des neutrophiles Figure 2A Des signaux positifs ont également été détectés dans les cellules des villosités placentaires; ces cellules ont déjà été démontrées pour être des macrophages et des cellules cytotrophoblastiques figure 2A [1]

eau G, mesures de H5 ERT-PCR pour différents échantillons 1, mesure ERT-PCR du groupe témoin positif H5 2, mesure PCR en temps réel du groupe témoin positif H5 mesure ERT-PCR du groupe test 3, de le groupe blanc 4, et du groupe témoin négatif 5 6, mesure PCR en temps réel de l’eau 7, mesure ERT-PCR de l’eau bp, paires de bases Figure 2Voir les grandes séquences nucléotidiques de H5N1 glissement détectées dans les neutrophiles par hybridation in situ, microdissection et PCR en temps réel ERT-PCR A, signaux d’hybridation in situ positifs de H5N1 violet-bleu; flèches noires détectées dans des cellules CD15-positives rouge-brun; des flèches noires dans les villosités placentaires incrustées de macrophages et de cellules trophoblastiques dans les villosités placentaires étaient également positives pourpre-bleu; Flèches rouges; barre, 50 μm L’insert b montre l’élargissement de l’insert a, qui montre que les mêmes neutrophiles contiennent des séquences nucléotidiques H5N1 bar, 10 μm B et C, Trois mille leucocytes, disséqués du placenta infecté comme le groupe test B, Avant la barre de microdissection laser, 50μm C, Après microdissection laser, 50μm D et E, Préparations sanguines sans leucocytes, disséquées du placenta infecté en tant que groupe blanc D, Avant microdissection laser, 50 μm E, Après microdissection laser, 50 μm Trois mille leucocytes de Mesure du glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase GAPDH par réamplification de PCR Lane 1, PCR GAPDH du groupe témoin positif réamplification PCR de GAPDH du groupe témoin positif voie 2, sur le voie de groupe de test 3, du groupe témoin négatif voie 4, et de la voie de groupe vierge 5 voie 6, PCR GAPDH de la voie d’eau 7, réamplification PCR de GAPDH de l’eau G, Mesures de H5 ERT-PCR pour différents échantillons 1, mesure ERT-PCR du groupe témoin positif H5 2, mesure PCR en temps réel du groupe témoin H5 positif ERT-PCR mesure du groupe test 3, du groupe blanc 4, et du groupe témoin négatif 5 6, Mesure PCR en temps réel de l’eau 7, mesure ERT-PCR de l’eau bp, microdissection par paires de base et PCR en temps réel améliorée ont confirmé la présence de séquences virales H5N1 dans le pool cellulaire des neutrophiles. 2G recueillies à partir du placenta infecté par le virus H5N1 figure2B et 2C zones de pool sanguin qui étaient adjacentes aux villosités placentaires sans leucocytes figure 2D et 2E montré aucun signal d’ARN du virus H5N1 figure 2G Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase servi de contrôle interne pour la confirmation de l’ARN extraction lorsque les résultats étaient convaincants positifs Figure 2F Discussion Il n’y a aucun cas connu d’infection neutrophilique par le virus de la grippe humaine in vivo, et le résultat de notre étude représente, à notre connaissance, le Dans notre étude, nous avons trouvé que les protéines virales H5N1 et les séquences nucléotidiques localisées dans les neutrophiles placentaires et que les séquences H5 localisées dans les leucocytes parmi les villosités placentaires d’un patient infecté par le virus H5N1 Des signaux positifs étaient présents dans le cytoplasme et le noyau. Les neutrophiles immunopositifs NP et HA observés dans la rate indiquent que ce phénomène se produit probablement dans toute la circulation. Une phagocytose est une fonction importante des neutrophiles [8] In vitro, il a été rapporté que la grippe humaine [9] L’ADN de l’hépatite virale a été détecté dans les neutrophiles [10-12], et d’autres virus pourraient être phagocytés par les neutrophiles [13-15] Par conséquent, le virus H5N1 pourrait entrer dans les neutrophiles via la phagocytose de manière similaire Récemment, nous avons signalé la présence de récepteurs de la grippe aviaire à la surface d’un certain nombre de types de cellules humaines. , y compris les neutrophiles [16]; Le virus H5N1 pourrait entrer dans les neutrophiles via l’endocytose médiée par le récepteur Plusieurs virus, dont le cytomégalovirus et le virus d’Epstein-Barr, se sont répliqués chez les neutrophiles [17-19] La localisation nucléaire des protéines virales suggère que le virus H5N1 pourrait également être capable de se répliquer dans les neutrophilesL’évidence non équivoque des protéines virales H5N1 et des séquences nucléotidiques dans les noyaux et le cytoplasme des neutrophiles des patients atteints de grippe aviaire indique de nouveaux mécanismes de pathogenèse Ces cellules peuvent servir de vecteur viral dans la circulation systémique et peuvent causer de multiples infections des organes, Comme cela a été rapporté ailleurs [1] Il a été rapporté que le virus H5N1 pourrait répliquer dans les cellules dendritiques et réduire leur taux de survie [20] En outre, il a été observé que de nombreux leucocytes étaient apoptotiques dans les poumons d’un patient infecté par le virus H5N1. Par conséquent, le virus H5N1 peut accélérer la destruction des neutrophiles par la destruction directe ou l’apoptose et peut causer la neutropénie fréquemment observée dans l’infection par le virus H5N1 Parce que notre étude est dérivée de l’examen d’un cas unique de grossesse, l’universalité de cette découverte mérite une étude plus approfondie

Remerciements

Nous remercions Yong Guo, Zhengshan Chen, Peng Pan et Baokai Yang, pour leur aide dans la réalisation de ces expériences, et Zhigang Xie, pour son aide dans l’autopsie et la collecte de tissus. Soutien financier The International Collaboration Project Project 111; B 07001 du Ministère de l’éducation, Chine; la Fondation éducative Lifu; et le Programme national de recherche et de développement en haute technologie de Chine 863; 2006AA02Z452 à ACHYPotentiel conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits