Sérodiagnostic de l’infection par le bocavirus humain

Contexte Un nouveau parvovirus humain, le bocavirus humain HBoV, a récemment été découvert et associé à une maladie respiratoire chez les petits enfants. Cependant, de nombreux patients ont présenté de faibles charges virales, suggérant une persistance du HBoV et rendant problématique le diagnostic basé sur la réaction en chaîne de la polymérase. On a examiné les réponses des cellules B systémiques spécifiques du HBoV et évalué leur utilisation diagnostique chez les jeunes enfants atteints de maladie respiratoirePatients et méthodes Des échantillons sériques appariés de 117 enfants atteints de respiration sifflante aiguë, précédemment étudiés pour 16 virus respiratoires, ont été testés par immunoblot. utilisant 2 antigènes recombinants de la capside HBoV: la partie unique de la protéine virale 1 et de la protéine virale 2Résultats La protéine virale 2 était supérieure à la partie unique de la protéine virale 1 vis-à-vis de l’immunoréactivité. étaient positifs pour HBoV selon la réaction en chaîne de la polymérase a immunoglobuline I g M anticorps, 36 73% avaient des anticorps IgG et 29 59% présentaient des anticorps IgM et / ou une augmentation du taux d’anticorps IgG 22 patients avec une augmentation des taux d’anticorps, 20 91% avaient une forte charge d’ADN HBoV dans le nasopharynx , soutenant l’hypothèse qu’une forte charge d’ADN de HBoV indique une infection primaire aiguë, alors qu’une faible charge semble avoir une signification clinique moindre Dans un sous-groupe de patients qui ont été préalablement diagnostiqués comme ayant une infection aiguë au HBoV définie comme une charge virale élevée dans le nasopharynx, virémie et absence d’autres infections virales, 9 100% des 9 patients présentaient des signes sérologiques d’infection primaire. Dans le groupe témoin, 68 enfants présentant une respiration sifflante et dont la réaction en chaîne par polymérase était négative pour le HBoV dans le nasopharynx, 9 13% y compris 5 qui présentaient une augmentation des taux d’anticorps IgG et étaient virémiques Aucune réactivité croisée avec le parvovirus humain B19 n’a été détectéeConclusions Les infections respiratoires dues à l’HBoV sont systémiques, induisent des Les diagnostics sérologiques sont en corrélation avec des charges virales élevées dans le nasopharynx et avec la virémie. Le test sérologique est un outil précis pour révéler l’association de l’infection par le HBoV avec la maladie.

Les infections virales des voies respiratoires inférieures sont une cause majeure de morbidité et même de mortalité chez les nourrissons et les jeunes enfants. Les auteurs classiques sont les rhinovirus, les virus respiratoire syncytial, les virus influenza, les virus parainfluenza et les adénovirus, mais aussi les nouveaux envahisseurs. Le HBoV humain a également été découvert en 2005 à partir de NPA aspirés rhinopharyngés regroupés par un procédé appelé criblage de virus moléculaire, comprenant la PCR aléatoire, le séquençage à grande échelle et la bioinformatique [1]. La séquence et l’analyse phylogénétique de l’ADN génomique de HBoV ont montré que le virus est taxinomiquement le plus proche du genre Bocavirus de la famille des Parvoviridae nouvellement découvert Le premier parvovirus B19, le parvovirus B19, provoque des éruptions cutanées, des arthropathies, des anémies et des fœtus. mort Parmi les autres parvovirus humains, on trouve les virus adéno-associés et les nouveaux parvovirus 4, qui ont un impact clinique inconnu [2, 3] Les plus proches parents de HBoV sont le parvovirus bovin bocavirus et virus canin minute, qui infectent les vaches et les chiens, respectivement [1] Les infections bocavirus animaux sont principalement subcliniques le virus canin minute ou le parvovirus bovin comprennent l’insuffisance reproductrice, l’entérite et les maladies respiratoires néonatales [4-8] Depuis sa découverte, le virus HBoV a été reconnu dans le monde entier comme l’un des virus les plus courants dans les sécrétions respiratoires. %, selon la conception de l’étude, y compris la technologie de laboratoire, l’âge du patient et les symptômes L’HBoV est généralement trouvé chez les enfants de moins de 3 ans hospitalisés pour une maladie des voies respiratoires inférieures [9-16]. les résultats de la PCR sont négatifs pour le HBoV [12, 17-21]. Il existe donc de plus en plus de preuves que le HBoV est un virus pathogène pour l’homme qui cause des Cependant, un grand nombre de patients présentaient de faibles charges virales [17, 22-24], suggérant une persistance du HBoV et rendant problématique le diagnostic basé sur la PCR. Néanmoins, toutes les études réalisées avec ce virus ont été basées sur la PCR. L’objectif de notre étude était de déterminer si les infections HBoV symptomatiques chez les patients pédiatriques provoquent des réponses systémiques par anticorps et si ces réponses peuvent être utilisées pour le diagnostic des infections à HBoV chez les enfants. avec une maladie respiratoire

Patients, matériaux et méthodes

Patients et prélèvement d’échantillons Des enfants âgés de 3 mois à 15 ans admis au service de pédiatrie de l’hôpital universitaire de Turku, Turku, Finlande, du 1er septembre 2000 au 31 mai 2002 pour une respiration sifflante respiratoire aiguë ont été observés ailleurs [17, 26]. l’admission à l’hôpital, les NPA pour le diagnostic viral ont été obtenues par une procédure standard [26] Des prélèvements sanguins ont été réalisés à l’hospitalisation et 2 à 3 semaines après la sortie de l’hôpital et les sérums appariés ont été conservés à – 20 ° C. qui ont été inclus dans l’étude d’étiologie virale précédente, comprenant des études PCR de NPAs pour 16 virus adénovirus; HBoV; les coronavirus 229E, OC43, NL63 et HKU1; les entérovirus; les rhinovirus; virus grippaux A et B; métapneumovirus humain; virus parainfluenza 1-4; et le virus respiratoire syncytial, 49 19% des 259 étaient positifs pour l’HBoV par PCR [17] Des échantillons sériques appariés de ces 49 enfants positifs à l’HBoV ont indiqué l’âge, 21 ans; intervalle, 5 mois à 11 ans étaient disponibles pour la présente étude des échantillons de sérum appariés de 68 enfants sifflants choisis au hasard, âge moyen, 25 ans; compris entre 5 mois et 12 ans avec des APN avec des résultats PCR négatifs pour l’HBoV dans la même étude ont été inclus comme sujets témoins. La durée des symptômes, par exemple, toux avant l’admission à l’hôpital était en moyenne de 48 jours, 0-28 jours et L’étude a été approuvée par les comités d’éthique de l’hôpital universitaire de Turku en Finlande et de l’hôpital universitaire d’Helsinki Helsinki, en Finlande. La protéine virale 2 VP2 et la région unique des gènes de la capside VP1u HBoV de la protéine virale 1 correspondant aux nucléotides 3443-5071 et 3056-3442 ont été respectivement amplifiées par PCR haute fidélité à partir d’un plasmide contenant un clone HBoV quasi-complet GenBank accession no DQ000496 Les amorces comprenaient des sites de reconnaissance pour le tableau d’enzymes de restriction 1. Les amplicons ont été clones dans le vecteur d’expression de fusion His6 / T7 pET23b Novagen en utilisant des pratiques de clonage standard et transformée en hôte d’expression d’Escherichia coli BL21DE3 pLysS Invitrogen Pour la production de protéines, les souches E coli contenant VP1u et VP2 ont été maintenues en agitant à 37 ° C dans un bouillon Luria de 05 l ou un milieu de bouillon Terrific, respectivement, contenant 50 μg / mL d’ampicilline et 34 μg / mL de chloramphénicol Lorsque les cultures ont atteint une DO600 de 05, elles ont été induites pendant 3 h avec de l’isopropyl β -D-thiogalactoside 04 mM Les cellules ont été récoltées par centrifugation 10 min à 10 000 g à température ambiante, remises en suspension dans 25 mL de PBS, et lysées par sonication sur de la glace Les protéines marquées His6 / T7 ont été purifiées dans des conditions dénaturantes par chromatographie d’affinité en utilisant la résine Ni-NTA Qiagen conformément aux instructions du fabricant.

Séquences de slidePrimer utilisées pour amplifier les gènes de la capside pour le clonageSerologicalSerological Pour les tests immunoblot, les échantillons de protéines purifiées ont été séparés par PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose Protran BA 85; Whatman, Schleicher & amp; Schuell, qui ont été bloqués pendant 30 min avec du tampon de blocage 5% de lait sec et 02% Triton-X-100 dans du PBS à température ambiante puis traités avec les échantillons de sérum humain dans du tampon de blocage IgG, dilution 1:50; IgM, dilution 1:30 pendant 1 h à température ambiante Enfin, on a ajouté de l’IgG ou de l’IgM anti-humaine conjuguée à de la peroxydase de raifort, diluée dans un tampon de blocage 1: 500, et l’activité peroxydase a été démontrée par 3,3′-diaminobenzidine et H2O2. étape, la feuille a été lavée 3 fois pendant 10 min avec du PBS contenant 005% de Tween. Des bandes colorées ont été visualisées et considérées comme négatives ou des résultats équivoques positifs ont été considérés comme négatifs Le score a été fait avant la connaissance des résultats de PCR pour les échantillons de sérum HBoVAll ont également été testés pour les anticorps IgM et IgG du parvovirus B19 avec des IgG et IgM commerciales; La biotrine et les EIA IgG et β -VP1 spécifiques au type d’épitope [27-30] PCR quantitative La plupart des échantillons sériques appariés d’enfants avec des NPA positifs au HBoV par PCR ont été étudiés plus tôt par une PCR quantitative ciblant le gène NP1 [ 17] Tous les échantillons de sérum restants à l’exception des échantillons de 2 enfants qui n’étaient pas disponibles ont été soumis à une amplification de l’ADN HBoV à partir de 50 μL de sérum avec le kit QIAamp DNA Blood Mini Qiagen et élués dans 50 μL, dont 5 μ L a été utilisé dans un volume réactionnel total de 25 μL. Le mélange maître PCR universel TaqMan PE Applied Biosystems a été utilisé, et la PCR a été réalisée selon Allander et al [17], sauf que le cycleur thermique était Mx3005P QPCR System Stratagene, et les réglages étaient de 95 ° C pendant 10 min, suivis de 45 cycles de 95 ° C pendant 15 s et de 60 ° C pendant 1 min torticolis. Un résultat quantifiable positif a été obtenu avec aussi peu que 10 copies / μL du plasmide contenant HBoV ST2. [1] Pour éviter la contamination, les échantillons et la PCR les mélanges ont été préparés sous des hottes à flux laminaire dans des pièces séparées L’eau a été utilisée comme contrôle négatif

Résultats

Expression des protéines HBoV Les protéines VP1u et VP2 ont été exprimées dans des bactéries, et l’expression a été analysée par SDS PAGE figure 1 Les VP1u et VP2 his6 / T7 ont montré les poids moléculaires apparents de ~ 20 kDa et 65 kDa, respectivement. était bonne dans les deux cas, avec un échantillon de culture de 500 mL donnant ~ 8 mg de protéine recombinante purifiée par affinité

Figure 1Voir grande diapositive de téléchargement SDS PAGE colorée au bleu de BlueSoomassie montrant la protéine virale 2 VP2 A exprimée en procaryotes et la partie unique de la protéine virale 1 Les flèches VP1u B indiquent VP1u et VP2 M, étalon de masse moléculaire; p, protéine purifiée par affinité; w, lysat avec le gène VP exprimé; w / o, lysat sans gène de protéine viraleFigure 1View largeDownload slideCoomassie bleu-coloré SDS PAGE montrant la protéine virale exprimée en procaryote 2 VP2 A et la partie unique de la protéine virale 1 VP1u B flèches indiquent VP1u et VP2 M, poids moléculaire standard; p, protéine purifiée par affinité; w, lysat avec le gène VP exprimé; Les échantillons sériques appariés des 117 enfants sifflants ont été appliqués sur des membranes immunoblot contenant comme antigènes les deux protéines recombinantes de la capside du HBoV, VP1u et VP2, pour la détection des anticorps IgG et IgM spécifiques du bocavirus humain. Au total, 60 51% des 117 enfants avaient des anticorps IgG et 33 28% des 117 présentaient des anticorps IgM pour la protéine majeure de la capside VP2 Tableau 2 Les résultats des immunoblots VP2 ont été comparés aux résultats antérieurs de la PCR des NPAs [17], comme indiqué dans le tableau 2 Parmi les 49 enfants ayant des résultats HBoV positifs de PCR des NPA, 29 59% des 49 avaient des anticorps diagnostiques 24 [49%] sur 49 avaient des anticorps IgM spécifiques de HBoV, et 22 [45] %] sur 49 présentaient une augmentation détectable des anticorps IgG Sur les 22 enfants présentant une augmentation des IgG, 19 ont réellement présenté une séroconversion et 17 77% présentaient également des anticorps IgM Tous sauf un des sérodiagnososes 97% sont survenus chez des enfants âgés de ⩽ 3 ans

Figure 2Voir la grande diapositive téléchargeable Résultats représentatifs de l’immunotransfert d’anticorps IgG A et IgM B du bocavirus humain, en utilisant les protéines porteuses de l’antigène VP1u ou protéine VP2u, comme indiqué. Les bandes membranaires ont été traitées avec les premiers I et II échantillons de paires de sérum et montrent Les conversions d’IgG pour VP1u et VP2 A et l’apparition d’IgM pour VP2 B Les flèches noires et blanches indiquent les positions des antigènes VP1u et VP2, respectivement M, poids moléculaire Figure 2Voir les résultats représentatifs de l’immunotransfert d’immunoglobulines HBoV IgG A et IgM B, en utilisant des membranes membranaires traitées avec les premier et deuxième II échantillons de paires de sérum et montrer des conversions d’IgG à la fois pour VP1u et VP2 A et l’apparition d’IgM pour VP2 B Les flèches noires et blanches indiquent les positions des antigènes VP1u et VP2, respectivement M, poids moléculaire

Résultats de l’immunoblot de la protéine 2 VP2 du virus HBoV pour 117 enfants sifflants, comparé à l’aspiration nasopharyngée NPA [17] et aux résultats de la PCR sérique pour HBoVTable 2View grandDownload slideHuman bocavirus Résultats de l’immunoblot de la protéine VP2 du virus HBoV pour 117 enfants sifflants comparés au rhinopharynx HBoVAllander et al [17] ont suggéré qu’une forte charge d’ADN HBoV dans les NPA ⩾ 104 copies / mL indiquait une infection symptomatique primaire, alors qu’une charge virale plus faible reflétait probablement la persistance du virus. Le groupe avec HBoV- les résultats de PCR positifs ont donc été subdivisés en fonction de la charge d’ADN dans les NPA; 24 86% des 28 du groupe ayant une charge virale élevée présentaient un résultat d’anticorps diagnostiques contre 5 24% des 21 patients du groupe 2 du groupe de charge virale faible. Parmi les 22 patients présentant des augmentations d’anticorps IgG ou des séroconversions, 20 91% étaient en le groupe de charge virale élevée En outre, dans le groupe d’enfants avec HBoV en tant que seule PCR ayant trouvé une monoinfection HBoV dans le tableau 2, 9 82% des 11 avaient des résultats diagnostiques; 7 64% des 11 avaient des anticorps IgM et 8 73% des 11 présentaient une augmentation du taux d’anticorps IgG 7 dont on a observé une séroconversion Parmi les 12 patients initialement considérés comme ayant une monoinfection HBoV [17], 1 a été retrouvé porteur d’un picornavirus non typable Parmi les 9 enfants virémiques avec une forte charge d’ADN dans leurs APM et avec le HBoV comme seul résultat de PCR, 100% avaient un sérodiagnostic HBoV Parmi les enfants qui avaient des résultats PCR positifs pour HBoV et qui étaient co-infectés avec un autre virus respiratoire, 20 53% des 38 avaient un tableau de sérodiagnostic HBoV 2 Parmi les 49 enfants avec PCR NPA positifs, 31 63% avaient des échantillons sériques avec des résultats PCR positifs tableau 2, avec des niveaux d’ADN allant de 1 × 102 à 1 × 105 copies / mL [ 17] Dans le groupe témoin de 68 enfants avec NPA HBoV-négatif selon la PCR, 10 15% de 68 ont eu un résultat de diagnostic; 9 13% des 68 avaient des anticorps IgM, et 6 9% des 68 présentaient une augmentation du taux d’anticorps IgG 5 dont la table de séroconversion 2 a été notée. Parmi ces 6 patients témoins avec augmentation des IgG, 5 avaient des échantillons sériques avec des résultats de PCR En effet, 12 à 18% des 68 enfants avec PCR Négatifs étaient virémiques, avec des charges virales allant jusqu’à 106. copies / mL table 2La prévalence totale d’IgG anti-HBoV VP2 était de 35% ou 29% si seuls les premiers échantillons sériques étaient inclus dans le groupe des enfants sifflants avec des NPA HBoV-négatives selon l’âge moyen de la PCR, 25 ans; intervalle, de 5 mois à 12 ans Les séroprévalences parmi les différents groupes d’âge étaient les suivantes: & lt; 6 mois d’âge, 0% n = 3; 6- 12 mois, 17% n = 12; 1- 2 ans, 52% n = 21; 2 à 3 ans, 43% n = 14; 3- 5 ans, 27% n = 11; et <5 ans, 29% n = 7Selon le test d'anticorps VP1u, seulement 8 7% des 117 enfants avaient des IgG, 2 2% des 117 avaient des IgM et 3 3% des 117 avaient une augmentation des IgG 1 de qui est décrit dans la figure 2A Les 5 sérodiagnostics VP1u ne sont pas corrélés avec les résultats PCR NPA, mais toutes les sérodiagnososes sont survenues chez les enfants avec virémie et les résultats de diagnostic VP2 non montrés Sept des 8 enfants VP1u IgG positifs ont des anticorps IgG les tests sérologiques VP2 antigenB19 Tous les échantillons sériques ont été étudiés pour les anticorps IgM et IgG anti-parvovirus B19-VP1u et -VP2 Aucun résultat diagnostique B19 positif IgM ou indice de spécificité épitope faible [28, 29] chez les enfants séronégatifs pour HBoV. Dans l'ensemble du matériel clinique, un seul diagnostic de B19 a été rencontré chez un enfant de 6 ans séronégatif pour le HBoV dans le groupe témoin. Sur 17 enfants 117, 117 avaient des anticorps IgG anti-B19, 6 avaient des anticorps IgG anti-HBoV et 60 enfants porteurs d'anticorps anti-HBoV IgG, seulement 6 10% Comparaison entre les anticorps IgG B19 et 14 25% des 57 enfants non immunisés contre l'antigène HBoV

Discussion

La prévalence élevée des co-infections avec d’autres virus respiratoires [9-12, 14, 17, 18] est positive pour l’HBoV. En effet, chez les enfants asthmatiques de notre étude, non seulement la plupart des patients avec une monoinfection de l’HBoV, mais aussi la moitié de ceux qui ont été co-infectés par d’autres virus ont présenté un sérodiagnostic de l’infection par le HBoV, indiquant que le HBoV est aussi systémique chez les individus co-infectés et devrait être pris en compte dans le diagnostic de maladie respiratoire. les NPA avec des résultats PCR négatifs pour l’âge moyen de l’HBoV, 25 ans; Cependant, cela ne peut pas être considéré comme une séroprévalence générale de l’HBoV dans ce groupe d’âge en raison du fait que tous nos enfants avaient été recrutés sur la base de leurs tests respiratoires. Symptômes Selon la PCR, l’infection aiguë par le HBoV s’est avérée la plus fréquente chez les enfants âgés de 6 mois à 3 ans [9-16] Il est possible que les enfants de 6 mois soient protégés par des anticorps maternels Dans notre étude, cependant, seulement 5 enfants étaient âgés de 5 à 6 mois dans le groupe de co-infection et 3 dans le groupe témoin, et aucun n’était séropositif pour l’HBoV. La séroprévalence semblait augmenter avec l’âge, atteignant un maximum de 52% chez les enfants de 1 à 2 ans. l’âge et ensuite diminuer jusqu’à 27% chez les enfants de 3 à 5 ans Cette diminution suggère que l’antigène dénaturé, qui est inhérent à la méthode immunoblot, pourrait ne pas être reconnu par les anticorps immunitaires passés des enfants plus âgés. La dépendance est caractéristique de l’immunité des cellules B du virus B19 [27-29, 41, 42]. Ce phénomène, en plus de l’infection de la muqueuse superficielle, pourrait également expliquer pourquoi tous les patients ayant une charge virale faible ne sont pas IgG positifs. avec l’hypothèse de la persistance du virus longtemps après l’infectionCertaines preuves de reconnaissance croisée sérologique entre les parvovirus humains et bovins et, plus spécifiquement, entre B19 et le parvovirus bovin bovin ont été observées [8, 43], même si ces deux derniers sont phylogénétiquement éloignés et la similarité de leur séquence protéique de capside est faible [44] Pour s’assurer que les anticorps contre B19 ne réagiraient pas avec le HBoV et interféreraient ainsi avec nos résultats, tous les enfants ont été examinés pour leur immunité contre les lymphocytes B19. enfants positifs dans le groupe IgG négatif pour le HBoV que dans le groupe IgG positif pour HBoV En outre, aucun enfant n’a été trouvé positif à la fois pour les IgM B19 et HBoV. En effet, les anticorps B19 n’interfèrent pas avec les résultats des anticorps anti-HBoV. Allander et al [17] ont trouvé l’ADN du HBoV dans les NPA de 49 19% des 259 enfants sifflants, dont 28% avaient une charge élevée d’ADN HBoV et 12,5% d’entre eux. infectés par le HBoV seulement Les infections associées à de faibles charges virales étaient toutefois fréquentes et suggéraient la persistance du virus. Une charge virale élevée et une virémie ont été notées principalement en l’absence d’autres virus respiratoires, suggérant un rôle causal de l’HBoV dans les sifflements aiguës. étude, les résultats sérodiagnostiques soutiennent fortement cette causalité Une charge virale faible dans le nasopharynx semble donc avoir peu de signification clinique Bien que le test immunoblot VP2 utilisé ici ne soit pas l’outil de diagnostic final, nos résultats montrent clairement la valeur diagnostique de sérologie tests dans l’infection aiguë par le HBoV Les critères de diagnostic d’une infection par le bocavirus sont actuellement non résolus L’utilisation de la seule PCR positive au HBoV se traduit par des NPA comme critère, dans certains cas. De plus, un certain nombre de faux diagnostics seraient obtenus, peut-être à la suite d’une persistance de l’ADN de l’HBoV ou d’une contamination des muqueuses. Des tests sérologiques, couplés à une PCR quantitative, devraient être inclus dans le diagnostic. diagnostic, comme indiqué ici, pour renforcer l’association causale entre HBoV et les maladies respiratoires Avec cette combinaison d’outils de diagnostic, il est maintenant possible d’évaluer également d’autres manifestations cliniques possibles causées par HBoV, comme la gastro-entérite pédiatrique [45] contexte et dans quelle mesure, ce virus affecte les personnes immunodéprimées, les femmes enceintes et les personnes âgées est actuellement inconnue. Une connaissance supplémentaire de la capacité neutralisante et de la longévité de l’immunité à l’HBoV est également requise.Il est montré ici, à notre connaissance pour la première fois. Les infections dues à l’HBoV provoquent une réponse systémique des lymphocytes B, comprenant à la fois des IgM et des IgG. montrent que la principale cible de cette réponse est la protéine capside majeure VP2, alors que la région unique de la protéine mineure VP1u est moins immunoréactive. Par mesure des anticorps spécifiques du HBoV, il est possible d’identifier les infections aiguës à HBoV chez les jeunes enfants hospitalisés pour Maladie respiratoire sévère Pour une puissance diagnostique maximale, une PCR quantitative et un test sérologique doivent être effectués

Remerciements

Nous remercions Kaisa Kemppainen et Kaisu Kaistinen pour leur aide technique. Soutien financier Helsinki University Central Hospital Research & amp; Éducation et recherche & amp; Les fonds de développement, la Fondation Sigrid Jusé lius et l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’innovation de KK, LH, KH et MSV; la Fondation Torsten et Ragnar Sö derberg à TA; et l’Académie de Finlande à OR, TJ et PL; Code du projet 1122539 pour les conflits d’intérêts KK, LH, KH et MSVPotentiel Tous les auteurs: pas de conflits