Structure Développement guidé de puissants inhibiteurs de liaison de la pénicilline liant de manière réversible

protéines liant la pénicilline (PBPs) catalysent des étapes dans la biosynthèse du peptidoglycane, qui est un composant majeur de la paroi cellulaire bactérienne (pour les revues, voir réfs (1) et (2)), et leur inhibition provoque des irrégularités dans la structure cellulaire, la lyse et éventuellement mort cellulaire3. Les PBP sont inhibées par les antibiotiques β -lactam (y compris les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes, Figure 1a) .1a). À partir des années 1940, des efforts de synthèse et de criblage très substantiels ont été faits pour optimiser les chaînes latérales des antibiotiques en vue d’améliorer leur puissance, leur spectre d’activité et leur pharmacocinétique (pour une revue, voir ref (4)) . La majorité de ce travail a été réalisée en l’absence de connaissances structurelles détaillées sur les PB, qui ont commencé à émerger au cours de la dernière décennie.1,2,5 Figure 1 Inhibition réversible et réversible des PBP. a) les antibiotiques à base de pénicilline et de céphalosporine; (b) la réaction d’antibiotiques β -lactame avec une PBP ou une β -lactamase; (c) l’approche analogique intermédiaire; (d) structures d’analogues intermédiaires …Le problème persistant et grandissant de la résistance aux antibiotiques de type # β -lactame dus aux β -lactamases a motivé le travail vers l’identification d’inhibiteurs de PBP non hydrolysables.6 Une approche implique l’utilisation d’électrophiles correctement fonctionnalisés (parfois appelés comme analogues de l’état de transition) qui réagissent de manière réversible avec la sérine du site actif nucléophile des PBP. Des inhibiteurs à base de peptides de PBPs de Streptomyces (R61), 7 Escherichia coli (PBP 5), 8 Neisseria gonorrheae (PBP 3/4), 9 et Actinomadura (R39) 10 ont été rapportés. Suite à ces efforts pionniers, il a été récemment rapporté que les acides aryl boroniques inhibent R39.11. Nous rapportons ici l’identification et l’analyse structurale de puissants inhibiteurs de l’état de transition non acylants de R39. À la suite de travaux avec différents types d’électrophiles, l’activité des acides acétamido-boroniques a été optimisée par des analyses informatiques et cristallographiques. Les résultats démontrent comment une approche structurellement informée peut être appliquée à l’inhibition de la PBP. Une approche analogue devrait être applicable à d’autres types d’inhibiteurs de PBP, y compris les # -lactames. La catalyse à la fois par les PBP et les sous-familles de sérine de β -lactmases passe par un complexe enzymatique acyle − “ tétraédrique ” des intermédiaires sont impliqués dans la formation et la décomposition de ce complexe (Figure 11b) .7 − 10 Plusieurs classes d’électrophiles sont proposées comme analogues structuraux de ces intermédiaires tétraédriques, y compris les trifluométhylcétones, les phosphonates et les acides boroniques. (Figure ​ (Figure 1c) .1c) En utilisant une structure cristalline du complexe enzymatique acyle − formé par réaction de la nitrocefine avec R39 (PDB ID 1W8Y) 12 pour le guidage (Figure ​ 2a), trois types d’électrophiles ont été identifiés puis synthétisés en tant qu’inhibiteurs potentiels (composés 1 − 17, figure ​ figure1d); 1d); pour les détails synthétiques, voir les informations de support. Les chaînes latérales choisies reflètent celles des antibiotiques de type # l003b2; -lactame, c’est-à-dire le groupe thiophèneacétyle de la céfalotine et le groupe 2,6-diméthoxyphényle de la méthicilline (d’intérêt car la majeure partie de cette chaîne latérale confère un certain nombre de résistance à la lactamase). Le criblage de ces inhibiteurs potentiels contre R39 a révélé peu ou pas d’activité pour les trifluorométhylcétones et les phosphonates (Supporting Information Table S1) mais a identifié les acides alkylboroniques 10 et 11 comme structures potentielles de plomb, avec des valeurs IC50 de 33 et 75 μ , respectivement (Tableau d’information de support S1). Figure 2 Vues de sites actifs à partir de structures de R39 (vert) liées à la nitrocefin (magenta, PDB ID 1W8Y (12)) et 10 (bleu, PDB ID 2XLN). (a) R39 &#x02212, complexe d’enzyme nitrocefin acyle − L’amide de la chaîne latérale de nitrocefin est positionné pour former des liaisons hydrogène … Nous avons ensuite déterminé une structure cristalline de 10 dans le complexe avec R39 pour étudier son mode de liaison (PDB ID 2XLN, figure &#x200B, figure2b2b et information de soutien Figure S1a) . La structure révèle la réaction de l’atome de bore électrophile avec O γ atome de site actif Ser49 pour former un produit d’addition tétraédrique. Ce complexe est apparemment stabilisé par des interactions de liaison hydrogène entre l’un des groupes hydroxyle boronate et les atomes d’azote du squelette de Ser49 et Thr413 (qui forme un trou d’oxyanion), d’une manière analogue à celle observée entre les deux. nitrocefin acyl − enzyme carbonyle oxygène et le trou oxyanion (Figure ​ (Figure2a) .2a). Le C – α le groupe de 10 est positionné à côté de celui de Leu349, ce qui pourrait expliquer pourquoi les analogues 12 avec des substituants plus encombrants qu’un groupe méthyle sont inactifs. Les amides de la chaîne latérale de la nitrocefine et 10 sont positionnés de façon à provoquer des interactions de liaison hydrogène similaires à la chaîne latérale Asn300 et au carbonyle Thr413 du squelette. Bien que les structures globales pour les complexes avec la nitrocefine et 10 soient très similaires, dans le cas de 10, la chaîne latérale de Tyr147 est tournée pour permettre une interaction apparente avec le cycle phényle de 10. Les données structurelles suggèrent que 10 réagit avec R39 pour former un mime raisonnable d’un complexe intermédiaire; par conséquent, il a été choisi comme point de départ pour une optimisation supplémentaire, en utilisant le logiciel de conception d’inhibiteur SPROUT.13,14 Dans cette stratégie, la protéine est d’abord examinée pour les sites potentiels d’interaction ligand. Les fragments sont alors “ ajoutés ” à la structure principale. Un système de notation basé sur l’affinité de liaison prédite, la complexité structurelle et l’accessibilité synthétique guide l’identification “ ” L’analyse informatisée initiale des complexes 10 et nitrocefin R39 révèle deux régions d’hydrophobicité relativement élevée que nous avons considéré comme pouvant être utilisées pour la modification structurelle.Une région (A) est adjacente aux positions 4 et 5 du cycle phényle de 10, et l’autre (B) est une zone d’espace relativement grande formée par Trp139, Asp142, Tyr147, Arg351 et Met414, qui est occupé par la chaîne latérale de la nitrocefine C-7 (figure ​ (figure2) .2). Une série d’inhibiteurs de l’acide boronique de seconde génération 18 (tableau 1) a été identifiée par modification informatique 10 en utilisant une bibliothèque de fragments virtuels d’éléments principalement hydrophobes. Les acides boroniques 18 et 27 ont ensuite été préparés pour explorer les relations d’activité de la structure dans les régions A et B, respectivement. Tableau 1: Activité de seconde génération (18 − 27) et de troisième génération (28 − Acides boroniques contre R39a La synthèse des acides boroniques 18 & spplus 27 a été adaptée à partir de la stratégie de Matteson et al., 15 à partir d’esters boronates formés à partir de (+) – (-) – pinanediol (Schéma 1). Les étapes clés sont l’homologation de la chaîne stéréosélective utilisant le dichlorométhyllithium et le déplacement nucléophile du chlorure avec le bistriméthylsilylamide. La déprotection de l’ester N- &#x003b1 -acétyl boronate a été obtenue par l’intermédiaire de l’intermédiaire trifluoroborate, formé par réaction des esters de boronate avec KHF2, suivie d’une hydrolyse acide.16,17Schéma 1Synthèse des inhibiteurs de l’acide boroniqueLes composés calculés 18 − 24, 26 et 27 (valeurs IC50 0,27 − 14 μ M) sont plus actives contre R39 que 10 (IC50 = 33 μ M) (Tableau 1). L’anneau de benzothiazole dans 19 (CI50 = 2,2 μ M) est prévu pour s’adapter parfaitement dans la plus petite région A. Conformément à cette proposition, un analogue 18, avec un anneau naphtyle plus grand, était moins actif (IC50 = 14 μ M). La présence de groupes volumineux à l’ortho-position améliore généralement la puissance, comme le démontrent les résultats pour 20% (score de SPROUT = − 7,04; − 7,27; − 7,37, respectivement; = 1,80, 1,31 et 0,27 μ M, respectivement). Une exception est le dérivé d’isopropyle ortho-substitué 25. Les composés les plus puissants dans cette série sont les composés 22 et 23, avec des valeurs IC50 de 0,27 et 0,50 μ M, respectivement. Une structure cristalline a ensuite été obtenue avec R39 (PDB ID 2XK1, figure ​ Figure3,3, information d’appui Figure S1b). Le mode de liaison de l’acide boronique avec Ser49 est très similaire à celui de 10 (Figure 2b), 2b), toutes les liaisons hydrogène apparentes étant conservées. La structure implique que les puissances accrues des énantiomères S (10, 20 et 23) par rapport aux énantiomères R (11, 27 et 26) sont dues à un meilleur ajustement des C – α Il est intéressant de noter que, comme l’ont prédit les études de modélisation, la présence de la chaîne latérale plus volumineuse de 20 (comparativement à 10) l’amène à adopter une conformation différente, dans laquelle le groupe benzyle occupe un espace défini. par les résidus Ser49, Glu178, Phe297 et Ser298 (région C). Pour que le groupe benzyle de 20 passe à “ naviguez ” la courbure aiguë dans la région C, le cycle phényle occupe la région B et le pont méthylène de 20 “ pour éviter l’interaction stérique avec la surface active du site.Figure 3 Vues à partir d’une structure cristalline de 20 (or) lié à R39 (vert) (PDB ID 2XK1). (a) Les liaisons hydrogène apparentes pour 10 (Figure ​ (Figure2) 2) sont conservées. Le groupe benzyle de 20 occupe la région C (dans la structure de la nitrocefine, celle-ci est occupée par … Le composé 20 a été considéré comme une dérivation intéressante pour diriger les substituants dans les deux régions B et C. La modélisation a donné lieu à un troisième ensemble de inhibiteurs 28 − 30 (Tableau 1) .Ces composés ont été conçus pour avoir une flexibilité restreinte en raison de leurs substituants ortho et ont été prédits avoir de meilleures affinités de liaison par rapport à 20 (Informations de Support Figure S3). ont montré des améliorations significatives dans leurs puissances (IC50 = 0,37 μ M, Ki = 105 et 63 nM, respectivement) (Tableau 1), validant ainsi l’approche de modélisation basée sur la structure pour l’optimisation de la chaîne latérale. La combinaison d’analyses cristallographiques couplées à la modélisation peut considérablement améliorer la puissance de l’inhibiteur de la PBP au plomb pour générer certains des inhibiteurs de PBP les plus puissants et les plus puissants non encore décrits. ic, une approche structurellement informée révèle également comment une région précédemment inexplorée dans le site actif PBP peut être utilisée pour obtenir une puissante inhibition par liaison réversible des acides boroniques de faible poids moléculaire. Cette approche peut être utile pour le développement à la fois d’inhibiteurs améliorés de β -lactame et de liaison réversible, non-β -lactame. Des informations structurelles détaillées sur les PBP et les β -lactamases sont maintenant disponibles, et un défi sera d’utiliser ceci pour atteindre l’ampleur de la sélectivité et de la puissance requises pour des antibiotiques utiles.