Test de sensibilité aux antimicrobiens: un examen des principes généraux et des pratiques contemporaines

Une tâche importante du laboratoire de microbiologie clinique est la réalisation de tests de sensibilité aux antimicrobiens d’isolats bactériens significatifs. Les tests ont pour but de détecter la résistance possible aux agents pathogènes courants et d’assurer la sensibilité aux médicaments de choix pour des infections particulières. Méthodes de microdilution en bouillon ou instruments automatisés utilisant des matériaux et des dispositifs commercialisés commercialisés Les méthodes manuelles qui offrent flexibilité et économies possibles comprennent les méthodes de diffusion et de diffusion par gradient. Chaque méthode a ses forces et ses faiblesses, y compris les organismes testés avec précision. fournir des résultats quantitatifs, p. ex. concentration minimale inhibitrice, et fournir des évaluations qualitatives en utilisant les catégories sensibles, intermédiaires ou résistantes. En général, les méthodes d’essai actuelles permettent une détection précise des mécanismes de résistance aux antimicrobiens courants site. la fusion des mécanismes de résistance nécessite une vigilance constante quant à la capacité de chaque méthode d’essai à détecter avec précision la résistance

Émergence de la résistance aux antimicrobiens et justification des tests de sensibilité

La performance des tests de sensibilité aux antimicrobiens par le laboratoire de microbiologie clinique est importante pour confirmer la sensibilité aux agents antimicrobiens empiriques choisis, ou pour détecter la résistance dans des isolats bactériens individuels. La thérapie empirique continue d’être efficace pour certains pathogènes bactériens. sensibilité à la pénicilline de Streptococcus pyogenes Les tests de sensibilité des isolats individuels sont importants pour les espèces possédant des mécanismes de résistance acquis, par exemple les membres des Enterobacteriaceae, les espèces Pseudomonas, les espèces Staphylococcus, les espèces Enterococcus et Streptococcus pneumoniae.

Vue d’ensemble des méthodes d’essai de susceptibilité couramment utilisées

Tests de dilution en bouillon L’une des premières méthodes de test de sensibilité aux antimicrobiens était la macrobrothie ou dilution en tube Cette procédure impliquait de préparer des dilutions doubles d’antibiotiques, par exemple,,,, et μg / mL dans un milieu de croissance liquide Les tubes contenant des antibiotiques ont été inoculés avec une suspension bactérienne normalisée de – × UFC / mL Après incubation pendant une nuit à ° C, les tubes ont été examinés pour la croissance bactérienne visible comme en témoigne la turbidité. concentration inhibitrice minimale CMI La précision de cette méthode a été considérée comme une concentration de plus ou moins deux fois, due en grande partie à la préparation manuelle de dilutions en série des antibiotiques L’avantage de cette technique était la génération d’un résultat quantitatif c.-à-d., le MIC Les principaux inconvénients de la méthode de macrodilution étaient la tâche fastidieuse et manuelle de préparer l’antibiotique les solutions pour chaque test, la possibilité d’erreurs dans la préparation des solutions antibiotiques, et la quantité relativement importante de réactifs et d’espace requis pour chaque testLa miniaturisation et la mécanisation du test par l’utilisation de petits plateaux en plastique « microdilution » jetables tests de dilution en bouillon pratiques et populaires Les plateaux standard contiennent des puits contenant chacun un volume de mL qui permet de tester approximativement les antibiotiques dans une gamme de dilutions doubles dans un seul plateau Les panneaux de microdilution sont généralement préparés à l’aide d’instruments de dosage précis. volumes d’antibiotiques pré-pesés et dilués dans le bouillon dans les puits individuels des plateaux des grands vaisseaux Des centaines de plateaux identiques peuvent être préparés à partir d’un seul ensemble maître de dilutions dans une période relativement brève. Peu de laboratoires de microbiologie clinique préparent leurs propres panneaux; les panneaux de microdilution congelés ou séchés sont achetés auprès de plusieurs fournisseurs commerciaux. Le coût des panneaux pré-préparés varie d’environ $ à $ chacun. L’inoculation de panneaux avec le standard × CFU / mL est réalisée en utilisant un dispositif jetable qui transfère en mL de bactéries normalisées. suspension dans chaque puits du plateau de microdilution ou à l’aide d’un distributeur mécanisé Après incubation, les CIM sont déterminées à l’aide d’un dispositif de visualisation manuel ou automatisé pour l’inspection de chacun des puits du panneau pour la croissance

Vue en grosDossier de microdilution de bouillon contenant des puits de réactif et un inoculateur jetable de plateauFigure View largeTélécharger Diapositive de microdilution d’un bouillon contenant des puits de réactif et un inoculateur à plateaux jetablesLes avantages de la procédure de microdilution incluent la génération de CMI, la reproductibilité et la commodité des panneaux pré-préparés et l’économie des réactifs et de l’espace due à la miniaturisation du test. Il est également utile de générer des rapports informatisés si un lecteur de tableau automatisé est utilisé. Le principal inconvénient de la méthode de microdilution est la rigidité des sélections de médicaments. méthode du gradient La méthode de diffusion du gradient antimicrobien utilise le principe de l’établissement d’un gradient de concentration antimicrobienne dans un milieu gélosé comme moyen de déterminer la susceptibilité. Le test bioMérieux AB BIODISK est une version commerciale disponible aux États-Unis Il utilise de fines bandelettes de test en plastique imprégnées sur le dessous d’un gradient de concentration d’antibiotiques séchés et marquées sur la surface supérieure d’une échelle de concentration. On peut placer radialement des bandelettes à la surface de une plaque de gélose -mm appropriée qui a été inoculée avec une suspension d’organisme normalisée comme celle utilisée pour un test de diffusion de disque Après une nuit d’incubation, les tests sont lus en regardant les bandes du haut de la plaque. partie inférieure de la zone d’inhibition de la croissance en forme d’ellipse avec la bandelette réactive

Figure View largeTélécharger Un isolat de Staphylococcus aureus testé par la méthode de diffusion par gradient de Etest avec la vancomycine VA, la daptomycine DM et le linézolide LZ sur agar Mueller-Hinton La concentration minimale inhibitrice de chaque agent est déterminée par l’intersection de la croissance de l’organisme et de la bande Un échantillon de Staphylococcus aureus testé par la méthode de diffusion par gradient de Etest avec la vancomycine VA, la daptomycine DM et le linézolide LZ sur gélose Mueller-Hinton La concentration minimale inhibitrice de chaque agent est déterminée par l’intersection de l’organisme La méthode de diffusion en gradient a une flexibilité intrinsèque en permettant de tester les médicaments que le laboratoire choisit. Les bandes d’Etest coûtent environ $ – $ chacune et peuvent représenter une approche coûteuse si plus de quelques médicaments sont utilisés. Cette méthode est la mieux adaptée aux situations dans lesquelles une MIC ou seulement si des médicaments sont nécessaires ou quand un organisme exigeant nécessitant un milieu enrichi ou une atmosphère d’incubation spéciale doit être testé, par exemple, pénicilline et ceftriaxone avec pneumocoques Généralement, les résultats de Etest sont bien corrélés avec les MICs ] Cependant, il existe des biais systématiques vers des CMI supérieures ou inférieures déterminées par Etest lors du test de certaines combinaisons agent-agent antimicrobien Cela peut représenter une lacune potentielle lorsque des critères d’interprétation MIC standard dérivés des tests de dilution en bouillon sont appliqués à Etest MIC qui peuvent ne pas être identiques Test de diffusion du disque La méthode de diffusion par diffusion du disque est simple et pratique et a été bien standardisée. Le test est réalisé en appliquant un inoculum bactérien d’environ – × CFU / mL à la surface d’un grand mm. plaque d’agar de Mueller-Hinton de diamètre Jusqu’à la concentration fixée industriellement, les disques d’antibiotique de papier sont placés sur le inoculé Les zones d’inhibition de la croissance autour de chacun des disques antibiotiques sont mesurées au millimètre près. Le diamètre de la zone est lié à la susceptibilité de l’isolat et à la taux de diffusion du médicament à travers le milieu gélosé Les diamètres de zone de chaque médicament sont interprétés en utilisant les critères publiés par le CLSI, anciennement le Comité national des étalons de laboratoire cliniques ou NCCLS ou ceux inclus dans le US Food and Administration des médicaments Inserts de produits approuvés par la FDA pour les disques Les résultats du test de diffusion des disques sont «qualitatifs», car une catégorie de susceptibilité, sensible, intermédiaire ou résistante, est dérivée de l’essai plutôt que d’un MIC. Les systèmes de lecteurs de zones disponibles prétendent calculer une CMI approximative avec certains organismes et antibiotiques en comparant les tailles de zone à celles standard d courbes de cette espèce et médicament stocké dans un algorithme

e, ou résistant en utilisant les derniers tableaux publiés par le CLSIThe les avantages de la méthode du disque sont la simplicité du test qui ne nécessite aucun équipement spécial, la fourniture de résultats catégoriques facilement interprétés par tous les cliniciens, et la flexibilité dans la sélection des disques pour test. le moins coûteux de toutes les méthodes de susceptibilité environ $ – $ par test pour les matériaux Les inconvénients du test du disque sont le manque de mécanisation ou d’automatisation du test Bien que toutes les bactéries fastidieuses ou à croissance lente ne puissent pas être testées avec précision a été standardisé pour tester les streptocoques, Haemophilus influenzae et N meningitidis en utilisant des milieux spécialisés, des conditions d’incubation et des critères d’interprétation de taille de zone spécifiques. Systèmes d’instruments automatisés L’utilisation d’instruments peut standardiser la lecture des points finaux et produire souvent des résultats de test de sensibilité. une période plus courte que les lectures manuelles parce que le système de détection optique sensible s permettent la détection de changements subtils dans la croissance bactérienne Certains instruments automatisés sont actuellement approuvés par la FDA aux États-Unis. Trois d’entre eux peuvent générer des résultats de test de susceptibilité rapide, tandis que le quatrième est un système nocturne. Diagnostics est un grand incubateur / lecteur autonome qui peut incuber et analyser des plateaux de microdilution. Le WalkAway utilise des plateaux de microdilution de taille standard qui sont hydratés et inoculés manuellement, puis placés dans l’une des fentes d’incubation de l’instrument. la période appropriée, en les examinant périodiquement avec un photomètre ou un fluorimètre pour déterminer le développement de la croissance Les panneaux de test de susceptibilité Gram négatif contenant des substrats fluorogènes peuvent être lus en h Les panneaux séparés Gram positif et Gram négatif lues en utilisant des extrémités turbidimétriques sont prêts en heuresLe système de microbiologie automatisé BD Phoenix BD Diagnost ics dispose d’un grand lecteur d’incubateur avec une capacité de traitement de panneaux contenant des puits dédiés à des dilutions doublement antibiotiques et inoculés manuellement. Le Phoenix surveille chaque panneau chaque minute en utilisant à la fois des indicateurs turbidométriques et colorimétriques de détection d’oxydoréduction. Les résultats MIC sont générés par – hLe système Vitek bioMérieux est hautement automatisé et utilise des cartes de réactifs en plastique très compactes de taille de carte de crédit qui contiennent des quantités microlitres d’antibiotiques et de milieux de test dans un bon format Le Vitek utilise une surveillance turbidimétrique répétitive de la croissance bactérienne pendant une période d’incubation abrégée. L’instrument peut être configuré pour accommoder – des tests simultanés Les cartes de sensibilité permettent de tester des bactéries aérobies Gram-positives et Gram-négatives courantes, et S pneumoniae dans une période de – h Un plus vieux, moins au Le système Vitek est encore utilisé dans certains laboratoires. Le système est plus limité avec une carte de visite et ne comprend pas S pneumoniae Le système de diagnostic ARIS X Trek de Sensititre est un système automatisé de nuit, d’incubation et de lecture avec une capacité de laboratoire. Les plaques sont des plaques de microdilution standard qui peuvent être inoculées avec un Sensititre Autoinculator. La croissance est déterminée par mesure de fluorescence après incubation. Des panels de tests sont disponibles pour les bactéries gram-positives et gram-négatives, S pneumoniae, Haemophilus et Grammer non-fermentaire. bacilli négatifLes instruments ARIS X, Vitek et WalkAway de Sensititre ont amélioré les logiciels utilisés pour interpréter les résultats de sensibilité, y compris les «systèmes experts» pour analyser les résultats des tests pour les profils atypiques et les phénotypes de résistance inhabituels. les résultats des tests de sensibilité rapide peuvent mener à des changements plus rapides des antimicrobiens appropriés apy, économies substantielles directes attribuables à la commande de moins de tests de laboratoire supplémentaires, exécution de moins de procédures invasives, et une durée raccourcie de séjour Ces avantages sont mieux réalisés couplés avec des calendriers de personnel de laboratoire étendus, et transmission électronique en temps réel des résultats vérifiés L’une des faiblesses précoces des méthodes de test de sensibilité rapide était une moindre capacité à détecter certains types de résistance antimicrobienne, y compris les β-lactamases inductibles et la résistance à la vancomycine. Cependant, les instruments récemment approuvés par la FDA ont connu des améliorations significatives. un logiciel informatique soit pour fournir une incubation prolongée pour des combinaisons organisme-médicament problématiques, soit en éditant des résultats de sensibilité en utilisant un logiciel expert pour éviter que des résultats improbables ne soient signalés. Dans certains cas, ces modifications entraînent une incubation prolongée. h de panneaux d’essai pour assurer des résultats précis, les rendant ainsi moins « rapide »

Sélection de médicaments pour les tests de routine

Le laboratoire doit tester et signaler les agents antimicrobiens les plus appropriés pour l’organisme isolé, pour le site de l’infection, et le formulaire de l’établissement Le CLSI fournit des tableaux qui répertorient les agents antimicrobiens appropriés pour tester les membres des Enterobacteriaceae, Pseudomonas , et d’autres non-fumeurs de glucose à Gram négatif, staphylocoques, entérocoques, streptocoques, Haemophilus, etc. Les listes comprennent des recommandations pour les agents qui sont importants à tester régulièrement, et ceux qui peuvent être testés ou rapportés sélectivement selon le formulaire de l’établissement. Les procédures de diffusion du disque et de diffusion en gradient offrent la plus grande souplesse, y compris les tests de nouveaux médicaments. La plupart des microdilutions en bouillon ou des tests automatisés contiennent des puits, ce qui limite efficacement le nombre d’agents testés ou la plage de dilution s de chaque médicament qui peut être inclus Les fabricants de panneaux préparés commercialement ont tenté de résoudre ce problème en offrant un certain nombre de configurations de panel standard différentes, ou en incluant moins de dilutions de chaque médicament dans un seul panneau Une autre solution à ce problème est Tester les agents antimicrobiens dont les activités sont essentiellement les mêmes que celles des médicaments sur formulaire recommandés Le document sur les tests de sensibilité CLSI énumère des groupes de certains agents antimicrobiens ayant des activités presque identiques pouvant constituer des solutions de rechange pratiques pour les essais.

Interprétation des résultats des tests de sensibilité

Les résultats d’un test de sensibilité doivent être interprétés par le laboratoire avant de communiquer un rapport au médecin du patient. L’interprétation optimale des CMI nécessite une connaissance de la pharmacocinétique du médicament chez l’homme et des informations sur le succès probable d’un médicament particulier dans l’éradication des bactéries. Le mieux est de se référer à une source experte telle que le CLSI, qui publie des critères d’interprétation des CIM de tous les antibiotiques pertinents pour la plupart des genres bactériens. En effet, les valeurs MIC et les diamètres des zones de diffusion des disques doivent être interprétés Tableau de valeurs relatives à l’efficacité clinique prouvée de chaque antibiotique et de diverses espèces bactériennes La taille de la zone CLSI et les critères d’interprétation MIC sont établis par analyse de types de données: données microbiologiques, y compris une comparaison des CMI et des tailles de zone. un grand nombre de souches bactériennes, y compris celles dont les mécanismes de résistance connus ont été définis phénotypiquement ou génotypiquement; données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques; Résultats d’études cliniques incluant des comparaisons de CMI et diamètre de zone avec éradication microbiologique et efficacité clinique obtenues lors d’études préalables à l’approbation FDA et commercialisation d’un antibiotique Un résultat « sensible » indique que l’organisme du patient doit répondre au traitement par cet antibiotique En revanche, un organisme avec une CMI ou une taille de zone interprétée comme «résistante» ne devrait pas être inhibée par les concentrations de l’antibiotique obtenues avec les doses normalement utilisées avec ce médicament Un résultat «intermédiaire» indique qu’un micro-organisme tombe dans une plage de susceptibilité dans laquelle la CMI approche ou dépasse le niveau d’antibiotique habituellement atteint et pour laquelle la réponse clinique est susceptible d’être inférieure à celle d’une souche sensible. l’antibiotique est fortement concentré dans un liquide corporel tel que l’urine, ou s’il est plus élevé que la normale Les doses de l’antibiotique peuvent être administrées en toute sécurité, par exemple, certaines pénicillines et céphalosporines. Parfois, le résultat «intermédiaire» peut également signifier que certaines variables du test de sensibilité peuvent ne pas avoir été correctement contrôlées et que les valeurs sont tombées dans un tampon. zone « séparation des souches résistantes de souches résistantes Généralement, la notification d’un résultat de catégorie de sensible, intermédiaire ou résistant fournit au clinicien les informations nécessaires pour sélectionner la thérapie appropriée. médicaments pour le traitement de l’endocardite infectieuse ou de l’ostéomyélite, dans lesquels la thérapie est susceptible d’être prolongée. Il est important que les tables utilisées pour les tests de sensibilité représentent les critères les plus courants. Les documents du CLSI sont fréquemment révisés et mis à jour fréquemment. ou des informations périmées des éditions originales d’étiquettes de médicaments approuvés par la FDA ou plus Les tableaux CLSI pourraient représenter une sérieuse lacune dans la déclaration des résultats des patients

Quelle est la précision acceptable d’une méthode de test de sensibilité?

Lors de l’évaluation de l’exactitude de diverses méthodes de test de sensibilité par rapport aux méthodes de référence standard, les termes erreurs très majeures et erreurs majeures ont été utilisés pour décrire les résultats faussement sensibles ou faussement résistants. un nombre représentatif de souches résistantes à divers médicaments pour vérifier la capacité du nouvel essai à détecter la résistance et à tester un certain nombre de souches sensibles pour déterminer le taux d’erreurs majeures qui pourraient être attendues dans un laboratoire clinique typique Pour être autorisée à être commercialisée aux États-Unis, la FDA exige que les erreurs les plus importantes attribuables à un dispositif d’essai soient de% pour les comparaisons entre espèces / médicaments, les erreurs majeures ne dépassent pas% et un accord MIC global de & gt; % de CMI des dispositifs dans une dilution double d’une CMI de référence CLSI Une récente norme internationale sur l’évaluation des dispositifs de test de sensibilité L’émergence de nouveaux mécanismes de résistance aux antimicrobiens, dont certains peuvent être difficiles à détecter, par exemple, la sensibilité intermédiaire à la vancomycine dans S aureus et la production de carbapénémases dans certains organismes Gram négatif, exige que les performances de Les appareils de susceptibilité doivent être constamment réévalués et mis à jour en cas de besoin. Dans certains cas, il est nécessaire d’utiliser des méthodes d’essai auxiliaires spéciales, par exemple, géloses à concentration unique, test Hodge modifié pour la production de carbapénémases

Méthodes d’essai actuelles et orientations futures

Les méthodes de test de sensibilité aux antimicrobiens décrites dans cet article fournissent des résultats fiables lorsqu’elles sont utilisées selon les procédures définies par le CLSI ou par les fabricants des produits commerciaux. Cependant, il existe une opportunité considérable d’amélioration dans le domaine de la reconnaissance rapide et précise de la résistance bactérienne. antibiotiques Il est nécessaire de développer de nouveaux instruments automatisés qui pourraient fournir des résultats plus rapides et économiser de l’argent grâce à des coûts de réactifs réduits et à des besoins réduits en main-d’œuvre. la détection directe des gènes de résistance par réaction en chaîne de la polymérase ou des techniques similaires a une utilité limitée, car seuls quelques gènes de résistance sont fermement associés à la résistance phénotypique, par exemple mecA, vanA et vanB Il existe des centaines de β-lactamases et de nombreuses mutations. acquisitions, et les mécanismes d’expression qui résultent i n résistance aux fluoroquinolones, aux aminoglycosides et aux macrolides ; trop nombreux pour être facilement détectés par les techniques moléculaires actuelles Ainsi, il semble probable que les mesures phénotypiques du niveau de sensibilité des isolats bactériens aux agents antimicrobiens continueront d’être cliniquement pertinentes pour les années à venir

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels JHJ et MJF divulguent leur appartenance à des comités consultatifs en microbiologie pour BD Diagnostics et bioMérieux JHJ a conseillé Accelr Technology et a bénéficié du soutien à la recherche de BD Diagnostics, bioMérieux, Merck, Pfizer et Siemens Healthcare